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Trivedi, Arun Kumar (2006): Proteomic identification of C/EBPa multiprotein complex reveals that JNK1, an activator of C/EBPa is downregulated in patients with acute myeloid leukemia (AML). Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Functional inactivation of the transcription factor CAAT Enhancer Binding Protein Alpha (C/EBPα) either by mutation or direct protein-protein interaction leads to acute myeloid leukemia (AML), whereas the activation of C/EBPα restores normal myeloid cell differentiation. We and others have shown that protein-protein interactions of C/EBPα play a pivotal role in myeloid differentiation and AML. In the present study we applied proteomics based mass spectrometry to identify C/EBPα interacting proteins on a proteome-wide scale. For this, the GST and GST-DNA binding domain of C/EBP (GST-DBD) was incubated with nuclear extracts of U937 cells. Interacting proteins separated by two-dimensional gel electrophoresis were identified by MALDI-TOF mass spectrometry. Using this approach we could identify PAK6, MADP-1, ZNF45 and the c-Jun N-terminal kinase 1 (JNK1) as C/EBPα interacting proteins. Since JNK1 activates c-Jun, the contra-player for C/EBPα, we hypothesized that the JNK1 and C/EBPα interaction might have some biological relevance. We could show that JNK1 binds to the DNA binding domain of C/EBP in GST-pull-down and to the C/EBPα in co-immunoprecipitation assays in-vitro and in-vivo respectively. JNK1 phosphorylates and increases the half life of the C/EBPα protein via inhibiting its ubiquitination and thereby enhances its transactivation and DNA binding activity. Furthermore, JNK mRNA expression as well as its kinase activity is lower in the AML patients in comparison to normal bone marrow mononuclear cells which implicates a possible mechanism of C/EBPα inactivation in certain acute myeloid leukemia subtypes. Thus our data suggest that a JNK activity is required for C/EBPα activation in myeloid cells and a loss of JNK regulated C/EBPα expression may contribute to leukemogenesis.

Abstract

Die funktionelle Inaktivierung des Transkriptionsfaktors CAAT Enhancer Binding Protein alpha (C/EBPα) entweder durch Mutation oder durch direkte Protein-Protein-Interaktion führt zu akuter myeloischer Leukämie (AML), wohingegen die Aktivierung von C/EBPα eine normale myeloische Differenzierung gewährleistet. Wir und andere konnten zeigen, dass Protein- Protein-Interaktionen von C/EBPα eine entscheidende Rolle in der myeloischen Differenzierung und AML spielen. In der vorliegenden Studie haben wir die auf Proteomik basierende Massenspektrometrie genutzt, um die mit C/EBPα interagierenden Proteine in einem Proteom-weiten Maßstab zu identifizieren. Zu diesem Zweck wurde ein Fusionsprodukt aus GST und der DNA-bindenden Domäne von C/EBPα mit Kernextrakten von U937 inkubiert. Mit C/EBPα interagierende Proteine wurden mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese separiert und durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie identifiziert. Mit diesem Ansatz konnten wir PAK6, MADP-1, ZNF45 und die c-jun N-terminale Kinase 1 (JNK1) als interagierende Proteine von C/EBPα identifizieren. JNK1 aktiviert c-jun, einen Gegenspieler von C/EBPα. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass die Interaktion von JNK1 und C/EBPα eine biologische Relevanz haben könnte. Wir konnten mittels GST-Pull-Down-Experimenten in-vitro zeigen, dass JNK1 mit der DNA-bindenden Domäne von C/EBP interagiert. Die Interaktion von JNK1 und C/EBPα konnte in-vivo durch Koimmunopräzipitation bestätigt werden. JNK1 phosphoryliert C/EBPα und erhöht dessen Halbwertszeit durch die Hemmung der Ubiquitinylierung. Dadurch wird die Stärke der Bindung von C/EBPα an die DNA und seine Fähigkeit zur Transaktivierung erhöht. Interessanterweise ist die Expression der JNK1-mRNA und die Kinaseaktivität von JNK1 bei AML-Patienten verglichen mit den entsprechenden Werten in mononukleären Zellen aus dem Knochenmark gesunder Kontrollpersonen erniedrigt. Dies weist auf einen möglichen Mechanismus zur funktionellen Inaktivierung von C/EBPα in bestimmten Subtypen der AML hin. 69 Zusammengefasst weisen unsere Daten darauf hin, dass die Aktivität von JNK1 für die Aktivierung von C/EBPα in myeloischen Zellen nötig ist, und dass ein Verlust der durch JNK1 regulierten Aktivität von C/EBPα einen möglichen Beitrag zur Leukämie-Entstehung leistet.