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Schmidt-Eisenlohr, Heike Barbara (2002): Pseudomonas chlororaphis (pJP4) als effizienter Rhizosphäre-Kolonisierer: Untersuchung fitness-relevanter Faktoren und Etablierung einer in situ-Detektionsmethode. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, verschiedene physiologische Parameter hinsichtlich ihres Einflusses auf die Kolonisierungs- und Plasmidtransfereffizienz von P. chlororaphis SPR044 in der Rhizosphäre von A. thaliana zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurden TnMod-Insertionsderivate mit Veränderungen "Quorum-Sensing"-regulierter Funktionen untersucht. Darüber hinaus sollten Auswirkungen von pJP4 auf die Fitness von SPR044 festgestellt werden. Weiterhin sollte eine Strategie zur in situ-Detektion plasmid-tragender Stämme in der Rhizosphäre entwickelt werden. Folgende Ergebnisse wurden erhalten: Das natürliche Isolat P. chlororaphis SPR044 produzierte BHSL, 3-OH-OHSL und ein weiteres, bisher nicht identifiziertes Acyl-HSL. Alle drei Acyl-HSLs wurden ebenfalls von den PCN-negativen SPR044-Derivaten sowie vom PCN-Überproduzierer produziert, nicht jedoch von den "Quorum-Sensing"-negativen Derivaten. Entsprechend der regulatorischen Funktion der Acyl-HSLs zeigten quantitative Analysen eine Korrelation zwischen der Menge von produzierten Acyl-HSLs, antimikrobiellen Metaboliten und extrazellulären Proteasen. Die einzige Ausnahme bildete der PCN-Überproduzierer. Dessen PCN-Überproduktion basiert vermutlich auf einer Veränderung des LPS und nicht auf der Ausschaltung eines negativen Regulators. In Einzelkultivierungs-Experimenten zeigte sich nach 14 Tagen kein Unterschied zwischen den Populationsgrößen des Wildtyps und der Derivate. Nach 28 und 42 Tagen war die Population des Wildtyps gleich groß wie die des PCN-negativen Derivats und signifikant größer als die des gacS-negativen Derivats und des PCN-Überproduzierers. In Kokultivierungs-Experimenten war die Population des gacS-negativen Derivats hingegen stets gleich groß wie die des Wildtyps. Eine Erklärung dieses Phänomens konnte durch Untersuchung der Wachstumskinetiken in Flüssigkultur erbracht werden. Die "Quorum-Sensing"-negativen Derivate wiesen eine stark verkürzte Lag-Phase und eine reduzierte Produktion des für die stationäre Phase spezifischen Sigmafaktors Rpos auf. Dies führte nach Koinokulation mit anderen Bakterien offenbar zu einer Aufhebung des selektiven Nachteils. Vermutlich nutzen die gacS-negativen Stämme komplexe C-Quellen, die durch die Enzyme des Wildtyps zugänglich gemacht werden und profitieren darüber hinaus von der verkürzten Lag-Phase. Die Frequenz des konjugativen pJP4-Transfers von SPR044 zu R. eutropha ist unabhängig von "Quorum-Sensing"- und PCN-Produktion. Die Transformation mit pJP4 per se hatte keinen negativen Einfluss auf die Rhizosphäre-Kolonisierungseffizienz von SPR044. Lag jedoch zusätzlich abiotischer oder biotischer Stress vor, manifestierte sich die metabolische Last durch pJP4 in einer verringerten Populationsgröße. Dieser Effekt war unabhängig vom "Quorum-Sensing"-System und der PCN-Produktion von SPR044. VirB5 von A. tumefaciens assembliert in einer höhermolekularen Struktur, die durch Scherkräfte von der Zelle gelöst und mittels Ultrazentrifugation sedimentiert werden kann. Bei verschiedenen Reinigungsschritten wurde eine Kofraktionierung mit der Haupt-Piluskomponente VirB2 beobachtet. VirB5 ist somit eine Nebenkomponente des T-Pilus. Das homologe Protein TraC aus dem IncN-Plasmid übt vermutlich eine ähnliche Funktion in pKM101-determinierten Pili aus. Zellfraktionierung pJP4-tragender P. chlororaphis-Zellen und Detektion mit spezifischen Antiseren deuten darauf hin, dass TrbC und TrbF Haupt- und Nebenkomponente pJP4-determinierter Pili sind. Bei TrbH handelt es sich um ein membran-assoziiertes Lipoprotein. Die Detektion pJP4-tragender Bakterien aus der Rhizosphäre war mit den TrbF- und TrbH-spezifischen Antiseren in situ möglich. Das TrbF-spezifische Antiserum ermöglichte die Erkennung IncP-Plasmid-tragender Bakterien. Das TrbH-spezifische Antiserum ermöglichte eine zusätzliche Unterscheidung zwischen IncPa- und IncPß-Plasmid-tragenden Zellen. Eine Kombination der Immunfluoreszenz-Analyse mit FISH erwies sich als geeignet für die Detektion von pJP4-Transfer zwischen SPR044 und R. eutropha in der Rhizosphäre von A. thaliana.