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Konstantopoulos, Nikolaos (2006): Häufigkeit von AV24+CD161+ NKT-Zellen und AV24-AJ18-TZR-Transkripten bei Atopikern und Nicht-Atopikern. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

In der Pathogenese atopischer Erkrankungen spielt IL-4 eine wichtige Rolle, da es den Switch zu IgE bewirkt. Außerdem führt IL-4 zur Ausreifung von naiven T-Zellen in TH2-Effektor-Zellen, welche die IL-4-Produktion ihrerseits aufrecht erhalten. Es konnte vermutet werden, dass diese Ausreifung durch sog. NKT-Zellen – die durch die gleichzeitige Expression eines T-Zell-Rezeptors mit einem NK-Zell-Marker sowie eine sehr hohe IL-4-Produktion charakterisiert sind - geschieht. Diese Zellen lassen sich durch die hochselektive Verwendung einer monoklonalen TZR-a-Kette (AV24) nachweisen. Fragestellung der vorliegenden Arbeit war, ob Atopiker gegenüber Nicht-Atopikern vermehrt NKT-Zellen aufweisen. Die Untersuchungen wurden in peripherem Blut freiwilliger, erwachsener Probanden durchgeführt. Atopiker wurden durch das gleichzeitige Vorhandensein klinischer Symptome, erhöhten Gesamt-IgEs und erhöhten spezifischen IgEs definiert. Bei den gesunden Probanden lagen weder klinische Symptome vor, noch waren Gesamt-IgE oder spezifisches IgE erhöht. Auf der zellulären Ebene wurden die Blutproben mittels Durchflusszytometrie analysiert. Innerhalb der CD4+, CD8bright, CD8dim sowie DN Lymphozyten wurde die Frequenz der Va24+CD161+ NKT- Zellen bestimmt. Auf der molekularen Ebene wurde der Anteil der AV24-AJ18-Transkripte an allen TZR-a-Ketten untersucht. Zur Überprüfung der Spezifität wurden 40 AV24-AJ18- Klone zusätzlich sequenziert. Um eventuelle Unterschiede innerhalb der CDR3- Region zwischen den beiden Probanden-Gruppen zu entdecken, wurde diese auf der Einzelnukleotidebene analysiert und hierfür eine neue Real-Time-PCR basierte Methode etabliert. Neben konventionellen Primer wurden zwei fluoreszenzmarkierte Sonden (FITC, LC-Red) verwendet, wobei es bei enger räumlicher Nähe zu einer Energieübertragung auf die fluoreszierende LC-Red Sonde kommt. Die Sondenlage wurde so gewählt, dass die detektierende Sonde die N-Region überragt und es inserierten N-Nukleotiden zu einer erniedrigten Schmelztemperatur kommt. Die genaue Sequenz eingefügter N-Nukleotide wurde durch Sequenzierung der Proben mit erniedrigter Schmelztemperatur überprüft. Inssgesamt wurden 29 erwachsene Probanden untersucht, 13 Atopiker und 16 gesunde Kontrollpersonen. Der Prozentsatz aller Va24+ Zellen betrug im Median 0,35% (Spannweite: 0,03-1,45%) ohne signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen. Zwischen der Anzahl aller Va24+ Zellen und CD8dim Va24+CD161+ Zellen bestand ein statistischer Zusammenhang (r=0,648; p<0,03; Spearman rho). Bei allen Probanden war die Absolutzahl der CD4+ und DN NKT-Zellen höher als die der CD8+ NKT Zellen. CD8dim NKT-Zellen waren bei den Atopikern tendenziell niedriger. Diese Erniedrigung war jedoch nicht signifikant. Es bestand keine Korrelation zwischen IgE-Spiegeln und NKT-Subtypen bei den Allergikern. Auch in den molekulargenetischen Untersuchungen fanden sich keine Unterschiede zwischen den Gruppen. Die AV24-AJ18/TZR a-Ketten Relation war gleichmäßig zwischen den Probandengruppen verteilt und betrug im Median bei den Allergikern 21,3% und bei den Kontrollen 18,1%. Der relative Anteil der AV24-AJ18 Transkripte innerhalb aller AV24+ Klone ergab ebenfalls eine gleichmäßige Verteilung zwischen beiden Probandengruppen ohne statistisch signifikanten Unterschied. Er betrug bei den Atopikern Median 5,3% (Spannweite 6 - 55,3%) und bei den Kontrollen Median 9,4% (Spannweite 6 - 40%). Auch hier bestand keine Korrelation mit Serum IgE-Werten. Bei der Analyse der N-Region zwischen AV24 und AJ18 mittels FRET und Schmelzkurvenanalyse fand sich bei 16/72 Klonen eine erniedrigte Schmelztemperatur. Vier dieser 16 Klone (zwei von Allergikern und zwei von Kontrollen) wiesen N-Nukleotide auf. Bei drei dieser Klone führte dies zu einer Aminosäuresequenz, die identisch mit der Aminosäuresequenz von NKT-Zellen ohne N-Region war, da gleichzeitig Aminosäuren im AV24-Gen deletiert waren. Nur ein von einem Allergiker stammender Klon zeigte eine abweichende Aminosäuresequenz. Mit den beschriebenen Methoden konnten weder auf zellulärer noch auf molekulargenetischer Ebene signifikante, quantitative Unterschiede bei erwachsenen Atopikern und Nicht-Atopikern festgestellt werden. Da Allergien in frühem Kindesalter geprägt werden, ist es jedoch möglich, dass NKT-Zellen in diesem Lebensalter erhöht sind und nach Etablierung eines TH2-Ungleichgewichtes auf ihre Ausgangswerte zurückkehren. Ein weiterer Untersuchungsansatz zur Klärung der Rolle von NKT-Zellen bei der Atopiegenese wären funktionelle Studien. Weiter ist es möglich, dass sich Veränderungen von NKT-Zellen in peripherem Blut nicht widerspiegeln, sondern nur erkrankte Gewebe wie Lunge oder Haut betreffen.