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Klement, Harald (2001): NADPH:Protochlorophyllid-Oxidoreduktase (POR): Untersuchungen zu einem „Schlüsselenzym“ der Chlorophyll-Biosynthese in Angiospermen. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

1. Es wurde eine Methode entwickelt, die POR nach der Solubilisierung aus Etioplasten chromatographisch zur Homogenität zu reinigen. Die spezifische Aktivität konnte gegenüber der POR in Etioplasten annähernd um das 14-fache gesteigert werden. Dabei wurden alle endogenen Pigmente und Lipide abgetrennt. So konnte erstmals überzeugend mit isolierter POR aus Pflanzen gezeigt werden, daß eine Bindung an das Substrat oder das Vorhandensein einer Membranumgebung keine Voraussetzung für den Erhalt der Aktivität darstellt. 2. Mittels detaillierter Pigment- und Proteinanalysen, inklusive densitometrischer Verfahren, konnte nachgewiesen werden, daß in Etioplasten ein Molekül Pchlide a an ein Molekül POR gebunden ist. 3. Substratspezifitätsstudien mit Substratanalogen zu Pchlide a zeigten, daß strukturelle Veränderungen an den Seitenketten des Porphyrinringes A und B, nicht aber Modifikationen am Ring D oder am isozyklischen Ring E, von der POR akzeptiert werden und zu photokonvertierbaren Substraten führen. Die Ergebnisse dieser Versuche lieferten ein neues Modell zu dem Mechanismus der Katalyse. Demzufolge sind die Ringe D und E am Boden der Enzymtasche fixiert und eine Enolatbildung an der Carbonylgruppe des Ringes E an der die Reaktion beteiligt. Die Ringe A und B liegen mehr oder weniger außerhalb der Enzymtasche. Erstmals konnte die Photokonvertierbarkeit von Pchlide b, Zn-[3-acetyl]-Protopheide a und Zn-[3-formyl]-Protopheide a gezeigt werden. 4. Kinetische Untersuchungen mit den Substratanalogen stellten die Auswirkungen der verschiedenen Seitenkettenmodifikationen auf die Reaktionsgeschwindigkeit heraus. Die Pigmente ließen sich in drei Gruppen mit einer „schnellen“ (z. B. Pchlide a), einer „mittelschnellen“ (z. B. [8-Vinyl]-Pchlide a) und einer „langsamen“ (z. B. Zn-71-OH-Protopheide a) Reaktionsgeschwindigkeit einteilen. Ein komplementärer Zusammenhang zwischen Fluoreszenz- und Photoreaktion-Quantenausbeute konnte nicht festgestellt werden. 5. Über die Bestimmung der KM-Werte für Pchlide a und Pchlide b (0,47 µM, respektive 0,63 µM) wurde demonstriert daß die Affinität beider Pigmente zu der PORA aus Hafer annähernd gleich groß ist. Chlorophyll c1 konnte als kompetetiver Hemmstoff für die POR identifiziert werden. 6. Bei der Photoreduktion tritt Substrathemmung auf. Dies konnte bei einem Überschuß an Pchlide a oder Pchlide b gegenüber der POR (> 1 mol Substrat/1 mol POR) gezeigt werden. 7. An solubilisierten Etioplastenmembranen und an solubilisierter, weitgehend aufgereinigter POR konnten die unterschiedlichen spektralen in vivo-Formen des photoaktiven endogenen Pchlide a dargestellt werden. Die nach der Photoreduktion auftretende spektrale Verschiebung des Chlide a (von A680 nm nach A672 nm), die mit dem in vivo auftretenden Shibata-Shift vergleichbar ist, konnte in diesen Proben gezeigt werden. Die in der Literatur postulierte Ursache des Shibata-Shift`s, eine Freisetzung des Chlide a aus den ternären Komplexen (POR-NADPH-Chlide a), kann anhand der hier erzielten Ergebnisse bestätigt werden. 8. Es wurde eine Methode entwickelt, mit deren Hilfe an solubilisierter und zur Homogenität gereinigter POR erstmals der Einfluß von Lipiden auf den spektralen Verlauf der Photoreduktion gezeigt werden kann. Nach der Dialyse einer Mischung von Einzelkomponenten (gereinigte POR, NADPH, MGDG/DGDG/Zn-Protopheide a-Gemisch) gegen 80 % Glycerin konnte die Photoumwandlung langwellig-absorbierender ternärer Komplexe, sowie die mit dem Shibata-Shift vergleichbare Verschiebung des Produktes in vitro dargestellt werden. 9. Die Ergebnisse dieser Rekonstitutionsversuche weisen darauf hin, daß in vivo die Einbettung der ternären Komplexe in die spezielle Lipidumgebung der Prolamellarkörper für die Bildung von unterschiedlich absorbierenden spektralen Formen des photoaktiven Pchlide a verantwortlich sind.