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Hess, Stefan (2005): Endothellzellproliferation und die Identifizierung neuer pro-angiogener Gene durch ein neuartiges Hochdurchsatz-Screen-System. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Das Blutgefäßsystem eines Organismus stellt eines der größten Organe des menschlichen Körpers dar. Den Grundbaustein der Gefäße bilden Endothelzellen, die durch eine einfache Zellschicht das gesamte System von innen auskleiden. Bei einer Vielzahl an physiologischen und pathophysiologischen Prozessen, wie beispielsweise dem weiblichen Menstruationszyk¬lus, der Wundheilung, den Entzündungsreaktionen oder aber der Ischämie und der Tumorpro¬gression, spielt das Endothel eine wesentliche Rolle. Die Aktivierung der Endothelzellen wird durch zahlreiche verschiedene Faktoren reguliert, die entweder im Blut zirkulieren, von be¬nachbarten Zellen oder aber auch von Tumorzellen sezerniert werden können. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde ein Hochdurchsatz-Screen etabliert, bei dem sich Gene mit einem pro-angiogenen Effekt identifizieren lassen. Hierzu erfolgte die individuelle Transfektion und Expression von 34.596 verschiedenen cDNAs in HEK 293-Zellen. Zur Testung wurden deren konditionierte Medienüberstände auf primäre Endothelzellen (HUVECs) transferiert. Zwei bereits aus der Literatur bekannte pro-angiogene Faktoren, bFGF und VEGF, wurden zur Protokoll-Etablierung als Positivkontrollen eingesetzt. Im Screen konnten insgesamt 13 cDNAs identifiziert werden, die einen pro-angiogenen Ef¬fekt zeigten. Unter ihnen fanden sich auch die zwei Positivkontrollen wieder, was einen direkten Beleg für die Funktionalität des Screens darstellt. Des Weiteren wurden vier bekannte und fünf unbekannte cDNAs identifiziert, bei denen bisher noch kein Zusammenhang mit Angiogenese gezeigt werden konnte. Die vier bekannten Gene kodieren für zytosolisch lokali¬sierte Proteine, deren Expression in verschiedene Säuger-Zellen zur Produktion und Sekretion pro-angiogener Faktoren führt. Im Anschluss an den Screen wurde eines der unbekannten Gene (NM_020746) detaillierter charakterisiert. Dieses Gen kodiert für ein 56,6 kDa großes Protein, das aufgrund erster Funk¬tionshinweise den Namen hSEP (human Stimulator of Endothelial Proliferation) erhielt. Die Expression von hSEP in HEK 293-, sowie in anderen Säuger-Zellen, generierte konditionierte Überstände, welche in Mangelmedium gehaltene Endothelzellen, nicht aber Fibroblasten zum Wachstum stimulieren. Mit Hilfe biochemischer Analysen wurde die Sekretion von hSEP nach der Expression in HEK 293-Zellen nachgewiesen. Besondere Bedeutung bei der Lokali¬sierung des Proteins kam hierbei einer bioinformatisch vorhergesagten C-terminalen Trans¬membrandomäne zu. Die Deletion dieser Domäne erzeugte ein deutlich effektiver sezerniertes Protein-Fragment (SEP1-510), führte allerdings gleichzeitig zu einem signifikanten Rückgang der Wachstums-Stimulation bei HUVECs. Des Weiteren ging die für hSEP nachgewiesene Lokalisierung im Golgi und ER zu Gunsten einer diffusen intrazellulären Verteilung verloren. Um den Wirkungsmechanismus von hSEP aufzuklären, wurden verschiedene Experimente durchgeführt. Expressionsanalysen von HEK 293-Zellen, die hSEP exprimierten, zeigten die Induktion verschiedener pro-angiogener Gene wie beispielsweise IL-8, RANTES und VEGF. Des Weiteren korrelierte die Anwesenheit von hSEP im Überstand nicht reproduzierbar mit der Stimulation von HUVECs. Außerdem gelang es nicht, aktives hSEP-Protein rekombinant zu erzeugen, welches für einen direkten Beweis seiner Funktionalität erforderlich gewesen wäre. Darüber hinaus wurden Hinweise auf eine Ko-Expression von hSEP mit VEGF unter hypoxischen Bedingungen sowie in verschiedenen soliden Tumoren gefunden. In welchen Zusammenhang die Expression dieser beiden Proteine steht, müssen weitere detaillierte Un¬tersuchungen zeigen. Insgesamt ist es denkbar, dass hierdurch neue mögliche therapeutische Ansätze für eine Inhi¬bition bei der Tumorangiogenese eröffnet werden könnten.