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Laner, Andreas (2005): Entwicklung von DNA- und Expressions-Markern zum Nachweis von menschlichen künstlichen Chromosomen und in vivo Transfektionsanalyse verbesserter HAC Vektoren. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Für die stabile, regulierte Expression eines therapeutischen Gens in Zielzellen stellen künstliche menschliche Chromosomen (HACs) derzeit das einzige Konzept dar, das hohe Sicherheit und technische Realisierbarkeit bietet. Künstliche Chromosomen (HACs) mit dem CFTR-Gen sollen sich durch den Transfer definierter HAC-Konstrukte effizient formieren, ohne dabei die Zielzellen zu stören. Im Augenblick werden künstliche Chromosomen zur Klärung vieler grundlegender Fragen auf dem Gebiet der Chromosomenstruktur und -funktion sowie der Genregulation konstruiert. In der vorliegenden Arbeit sollte die zugrundeliegende de novo HAC-Technologie der Arbeitsgruppe, die sich auf die Konstruktion und den intakten Transfer von PACs mit den funktionellen Komponenten menschlicher Chromosomen (zentromerische, telomerische und genomische Sequenzen mit oris und Gene) konzentriert, weiterentwickelt werden. Die Verwendung von PACs als Kloniervektoren erlaubt die stabile Klonierung langer, genomischer DNA, die biochemische Verknüpfung über lox/Cre vermittelte Rekombination, sowie die Darstellung grosser Mengen intakter, supercoiled PAC DNA durch Anwendung einer in der Arbeitsgruppe entwickelten Technik (Reinigung der supercoiled DNA Fraktion in Agaroseplugs von gebrochener und genickter DNA im elektrischen Feld). Eine Verbesserung der Vektoren ist nötig, da die Effizienz der HAC Formierung bisheriger Vektoren für eine klinische Anwendung nicht ausreicht. Dafür wurden zunächst Marker benötigt, die Anzeigen können wieviele Zellen mit wievielen Vektormolekülen transfiziert wurden und wieviele der physikalisch erfolgreich transfizierten Zellen stabile HACs bilden (genetische Funktion). Im Rahmen dieser Arbeit wurden Expressionsmarker entwickelt, die eine Formierung stabiler HAC-Linien durch grüne Fluoreszenz anzeigen können. So wurde ein tetratelomerischer PAC-Vektor „pTT“ konstruiert, der stabil eine EGFP-Kassette exprimiert, ein funktionelles Zentromer trägt (TTE1), und für die Klonierung weiterer genomischer Komponenten eine weiss/blau selektionierbare Sal I Stelle enthält. Ausserdem wurde ein CFTR-Gen-basierender „genomischer“ Marker (159 kb) vorgestellt, der den intakten Transfer langer, genomischer DNA und die Expression vom CFTR Promoter anzeigen kann. Besonders hervorzuhebende Ergebnisse aus der Arbeit sind: 1) Kopiezahlabhängigkeit bei der transienten Expression. Einzelne Markergen-Kopien genügen nicht, um Anwesenheit der transfizierten DNA mittels transienter Expression nachzuweisen. 2) Sichtbar transient exprimierende HAC Konstrukte (große Zahl) führen nicht zu stabilen Linien, was nahelegt, dass ein „low copy“ HAC Transfer benötigt wird. Für eine Optimierung und besseres „low copy“ HAC-Monitoring wurden multimere Marker (EGFP Array) und DNA-tags (Gal4-BD, Lac-Operator) entwickelt und stehen nun für einen Einsatz bereit. 3) Für den „low copy“ Transfer wurden neben Lipofektionsassays und der Mikroinjektion insbesondere eine neue Methode, die Baktofektion, eingesetzt, bei der die DNA nicht aus Bakterien isoliert werden muss: Modifizierte Transferbakterien dringen in die Zelle ein und geben die DNA-Konstrukte nach Autolyse frei („suicidal transfer“). Dabei wurde ein funktioneller Transfer genomischer DNA nachgewiesen. Es konnte zum einen gezeigt werden, dass Zentromer tragende Konstrukte effizient de novo HACs bildeten, und zum anderen, dass das lange genomische CFTR Expressionskonstrukt CGT21 stabil vom CFTR Promoter exprimiert wird. Damit steht nun die Baktofektion als effizienteste Methode zur HAC Optimierung zur Verfügung. 4) Durch Auszählung der stabilen Klone, Isolierung von Stichproben klonaler Linien und einem HAC-Formierungsassay mittels FISH Analyse, wurden folgende grundlegende Beobachtungen gemacht: Die Rate der Formierung stabiler Klone mit HAC Konstrukten hängt nicht von a) der Zahl der im einzelnen Konstrukt vorhandenen, oder cotransfizierten Zahl der BS Marker, b) nicht von der Orientierung der alpha-sat DNA relativ zum BS-Gen oder dem entgegengesetzt gerichteten EGFP-Gen, und c) nicht absolut von der Verwendung unterschiedlicher alpha-sat Sequenzen der zwei homogenen Array Typen auf Chr.5 ab, wobei der Vektor pTT mit dem Zentromer E1 die besten Ergebnisse der HAC Bildung erzielte und die höchsten Klonzahlen in Cotransfektionen mit einem telomerisierten Genkonstrukt erhalten wurden, nicht aber in Cotransfektionen mit dem Telomervektor ohne einklonierte genomische DNA. Diese Erkenntnisse haben direkte Relevanz für die Weiterentwicklung CFTR exprimierender HAC Vektoren. Mit den Konstrukten pTTE1 und CGT21, und den zukünftig erweiterten Konstrukten mit multimeren Markern bzw. Tags und einem kompletten CFTR Gen, kann nun auch der physikalische Transfer der HAC Konstrukte in Zielzellen, sowie deren Funktion effizient untersucht werden. Damit konnten wichtige Voraussetzungen für die Weiterentwicklung einer stabilen CFTR Gentherapie geschaffen werden.