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Schwarz, Bianca Christine (2005): Klonieren der felinen Zytokin-Gene IL-2, GM-CSF und IFNγ zum adjuvanten, nonviralen gentherapeutischen Einsatz beim Fibrosarkom der Katze. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

The feline fibrosarcoma is a spontaneous malignant soft tissue sarcoma. Due to the high recurrence rate of approximatelly 70 % even after radical surgical excision the prognosis is very poor. There have been carried out different gene-therapy protocolls adjuvant to tumour excision, yet. In the following study a local, nonviral gene-transfer with the feline cytokine-genes Interleukin 2, Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor and Interferon γ is conducted. As local gene delivery system serves a collagen-sponge loaded with a plasmid-DNA-PEI-PEG-formulation. The immunomodulating cytokines are expected to improve the antigen presentation, to activate immune effector cells and to generate memory cells against specific tumour antigens. The goal is to enhance tumour cell killing and anti cancer immune response to extend the tumour free survival time or even to decrease the recurrence rate in fibrosarcoma bearing cats. First a phase I dose escalation study is carried out using these vector-loaded collagen sponge. The adjuvant immunotherapy is combined with the surgical standard treatment of the feline fibrosarcoma. Blood was collected from healthy cats. Feline peripheral mononuclear blood cells were separated, cultured and stimulated in vitro by Concanavalin A. mRNA was isolated and reverse transcribed in cDNA. The cDNA served as template for the PCR amplification. Specific primers are based on already published sequences and introduced restriction endonuclease sequences in the amplified product. PCR products and expression vector were cut with these restriction enzymes. After ligation of PCR products and expression vector p55pCMV_ivs_luc+ transformation in DH 10 B bacteria was performed. Further analysed inserts were sequenced. Before therapeutic use the cytokines had to show biological activity. Recombinant proteins are expressed in the mammalian cell line COS-7. The feIL-2 and feGM-CSF bioactivity is demonstrated in proliferation assays, using the IL-2 and GM-CSF dependent cell lines CTLL-2 and TF-1. The biological acitivty of feIFNγ is measured by FACS analysis. A MHC I and II induction assay was performed on feline fibrosarcoma cells. After plasmid DNA preparation with polykation polyethylenimine and protective copolymers (polyethylene glycol) the collagen sponge is loaded with these gene vectors under sterile conditions. The vector loaded sponge is stored at 4 °C till implanted in the tumour bed of fibrosarcoma bearing cats.

Abstract

Das feline Fibrosarkom ist ein maligner Bindegewebstumor, der mit einer Rezidivrate von etwa 70 % auch nach radikaler Tumoroperation eine sehr schlechte Prognose hat. Verschiedene Gentherapieprotokolle wurden bereits adjuvant zur Tumorexstirpation durchgeführt. Bei der folgenden Studie soll ein lokaler, nonviraler Gentransfer der felinen Zytokin-Gene Interleukin 2, Granulozyten-Makrophagen Kolonie-stimulierender Faktor und Interferon γ stattfinden. Für den gentherapeutischen Einsatz in der Katze wird ein Kollagenschwamm als Trägermaterial mit der Plasmid-DNA in PEI-PEG-Formulierung beladen. Die immunmodulierenden Zytokine sollen die Antigenpräsentation verbessern, Effektorzellen des Immunsystems aktivieren und Memory-Zellen gegen die spezifischen Tumorantigene generieren. Ziel ist das Abtöten von Tumorzellen und die Bildung einer Antitumorimmunität um ein lokales Rezidiv des Fibrosarkoms zu verhindern oder die rezidivfreie Zeit und damit auch die Überlebenszeit der Katzen zu verlängern. Der Einsatz dieses Gentherapeutikums erfolgt zunächst in einer Phase I-Studie, in der die Verträglichkeit geprüft werden soll. Diese Immuntherapie soll adjuvant mit der chirurgischen Standardtherapie kombiniert werden. Aus dem Blut klinisch gesunder Katzen wurden periphere mononukleäre Blutzellen isoliert, angezüchtet und mit Concanavalin A stimuliert. Anschließend wurde aus den Zellen die mRNA gewonnen und mit Hilfe reverser Transkriptase in cDNA umgeschrieben. Diese diente als Matrize für die PCR, mit der die einzelnen Zytokin-Sequenzen amplifziert wurden. Spezifische, von den bereits veröffentlichten Sequenzen abgeleitete Primer führten Restriktionsschnittstellen in das amplifizierte Produkt ein. Sowohl die PCR-Produkte als auch der Vektor wurden mit diesen Restriktionsenzymen geschnitten. Nach Ligation der PCR-Produkte in das Expressionsplasmid p55pCMV_ivs_luc+ und Transformation von DH 10 B-Bakterien wurden die inserts der als positiv befundenen Plasmide sequenziert. Vor dem therapeutischen Einsatz der Zytokin-Gene wurde ihre biologische Aktivität überprüft. Die rekombinanten Proteine wurden in der Säugerzelllinie COS-7 exprimiert. In Proliferationsassays konnte die Bioaktivität von feIL-2 und feGM-CSF demonstriert werden, wobei die Zelllinien CTLL-2 und TF-1 benutzt wurden, welche in ihrem Wachstum vom entsprechenden Zytokin abhängig sind. Die biologische Aktivität von feIFNγ wurde durchflusszytometrisch mit MHC I- und MHC II-Induktionstests auf felinen Fibrosarkomzellen nachgewiesen. Nach Konjugation der Plasmid-DNA mit dem Polykation Polyethylenimin wurde dieser Komplex mit protektiven Kopolymeren (Polyethylenglycol) umhüllt und unter sterilen Bedingungen auf den Kollagenschwamm aufgebracht. Der Schwamm kann bis zur Implantation ins Tumorbett steril gelagert werden.