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Gnirke, Andrea U. (2000): Studien zur zellbiologischen Funktion des „Progressions-assoziierten Proteins“ (PAP) und dessen Bedeutung für die Invasivität von Mammakarzinomzellen. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Die Identifizierung von Genen, deren Expression Einfluß auf die Metastasierung von Tumoren nimmt, stellt eine Möglichkeit zur Verbesserung sowohl diagnostischer als auch therapeutischer Ansätze in der Behandlung von Krebs dar. Jede achte Frau in westlichen Industrienationen erkrankt an Brustkrebs, wobei die Entwicklung neuer Methoden zur frühzeitigen Erkennung von Metastasen und deren zielgerichtete Behandlung entscheidend ist, um eine Therapie von Patientinnen mit progressivem Mammakarzinom zu ermöglichen. Entwickelt sich eine Zelle eines Primärtumors zu einer invasiven metastasierungsfähigen Zelle, so ist für diese Veränderung des Phänotyps eine grundlegende Modifizierung in der Expression zahlreicher Gene zu erwarten. In einem zellulären Modellsystem für die Progression des Mammakarzinoms wurde in der invasiven Zellinie MCF-7ADR das „Progressions-assoziierte Protein“ (PAP) identifiziert, in der nicht-invasiven Zellinie MCF-7 konnte dagegen keine Expression nachgewiesen werden. Die Aufgabenstellung dieser Arbeit ist die Klärung der Bedeutung der Expression dieses Gens für die Veränderung einer Zelle von einem nicht invasiven hin zu einem invasiven Phänotyp. PAP stellt ein Protein mit 157 Aminosäuren dar und gehört zur PMP22-Genfamilie, deren Mitglieder putative Viertransmembran-Rezeptoren sind. Neben der Hypothese der Einflußnahme von PAP auf die Metastasierungsfähigkeit einer Zelle werden für die Homologen eine Vielzahl zellulärer Funktionen postuliert, wie z.B. die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten, Adhäsionsvermittlung, Zellzyklusregulation, Tumorgenese und Apoptose. Die in dieser Arbeit durchgeführten Expressionsstudien zeigten, daß PAP in einer Vielzahl von Normalgeweben exprimiert wird, mit Ausnahme von Geweben des Zentralen Nervensystems (ZNS) und peripherer Blutlymphozyten. Erste vergleichende Prävalenzstudien mittels Northern-Blot- Analysen zwischen Tumor- und Normalgewebe einzelner Patienten wiesen im Fall von Gewebeproben aus Organen des Zentralnervensystems eine positive Korrelation der PAP-Expression mit den Tumorproben auf. Eine Untersuchung von Mammakarzinom-Zellinien mit unterschiedlichem Metastasierungsgrad in der Nacktmaus belegte, daß PAP lediglich in den als metastasierend eingestuften Zellen exprimiert wurde. Über gekoppelte in vitro Transkription/Translation konnte gezeigt werden, daß die in einen Expressionsvektor klonierte PAP-cDNS für ein Protein mit einer Größe von etwa 18 kDa kodierte. Auch mittels Immunfluoreszenzstudien transient transfizierter COS-7-Zellen konnte die Expression eines Epitop-markierten Proteins und die Lokalisierung an der Zellmembran nachgewiesen werden. PAP exprimierende Zellen waren nicht apoptotisch, jedoch oft auffallend abgerundet. Einzelne Klone stabil transfizierter MCF-7-Zellen, die PAP konstitutiv exprimierten, zeigten kein anderes Wachstumsverhalten in Proliferationstests gegenüber der untransfizierten oder den mocktransfizierten MCF-7-Zellen. Auch ihr Verhalten in in-vitro-Invasionstests unterschied sich nicht von dem der Ursprungszellen, während MCF-7ADR hier starke Invasivität aufwies. Eine endgültige Aussage über eine Funktion von PAP bei der Invasion von Tumoren kann jedoch erst nach der Auswertung von Experimenten in Nacktmäusen gemacht werden. Durch Serumentzug wachstumsarretierte humane Primärzellen zeigten für PAP eine inverse Regulation im Vergleich zu dem homologen Protein PMP22. PAP wurde in proliferierenden Zellen stärker exprimiert als in arretierten, während für PMP22 ein Anstieg der RNS in arretierten Zellen zu beobachteten war. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, daß alleine die Expression von PAP nicht ausreicht, um MCF-7- Zellen in vitro zur Invasion zu befähigen. Dafür könnten allerdings sowohl extrazelluläre Stimuli, als auch intrazelluläre Interaktionspartner fehlen, die zur Änderung des Phänotyps der Zellen und zur Invasion notwendig sein könnten. Da Rezeptoren jedoch in allen Schritten der Metastasierung von grundlegender Bedeutung sind, kann auch für PAP nicht ausgeschlossen werden, daß es in diesen komplexen zellulären Mechanismen eine Rolle spielt. Ein Einfluß auf die Proliferationsfähigkeit von Zellen konnte durch die konstitutive Expression von PAP nicht nachgewiesen werden. Eindeutig belegt werden konnte aber eine Korrelation mit dem Zellzyklus. Durch Serumentzug arretierte primäre Zellen zeigten eine verminderte PAP-Expression im Vergleich zu proliferierenden Zellen. Die Überexpression von PAP in COS-7-Zellen läßt allerdings die Vermutung zu, daß PAP, ebenso wie das homologe PMP22, einen Einfluß auf die Zellmorphologie und auf die Adhäsion von Zellen haben könnte. PAP könnte dabei in einen Adhäsion-regulierenden Mechanismus eingebunden sein, der bei einer Überexpression von PAP zu einem Abrunden der Zellen und einem Substratkontaktverlust führen könnte. Unter physiologischen Bedingungen könnte dies für das Loslösen der Zellen während der G2-Phase des Zellzyklus notwendig sein. Bei einer fehlerhaften Regulation (einer gesteigerten Expression von PAP) unter pathologischen Bedingungen könnte eine leichtere Loslösung von Tumorzellen die Metastasierung begünstigen. Denkbar wäre eine Interaktion von PAP mit Integrin- Rezeptoren, wodurch die Affinität des Integrins beeinflußt werden könnte. Diese Hypothese bietet einen Ansatzpunkt für weitere Studien bezüglich des Einflusses von PAP auf zelluläre Vorgänge, wie Zellzyklus-Regulation und Zellwanderung.