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Meier, Stephan (2005): Untersuchungen zur Translokation und Insertion mitochondrialer Proteine über den Tim17-Tim23-Komplex. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Import von Präproteinen aus dem Cytosol in die mitochondrialen Subkompartimente. Der TIM23-Komplex der mitochondrialen Innenmembran ist für die Translokation von Präproteinen über die Innenmembran verantwortlich und vermittelt darüber hinaus die Insertion von Proteinen in die Innenmembran. Tim23 weist zwei funktionell unterscheidbare Domänen auf: Eine N-terminale hydrophile Rezeptordomäne im Intermembranraum und einen hydrophoben C-terminalen Bereich. Das phylogenetisch verwandte Tim17 ist ein sehr hydrophobes Protein, welches vier Transmembrandomänen ausbildet, die von zwei kurzen Enden im Intermembranraum flankiert werden. Die hydrophoben Bereiche von Tim17 und Tim23 bilden vermutlich den kanalbildenden Teil der Translokase. In der vorliegenden Arbeit wurde die Funktion von Tim17 bei der Translokation von Präproteinen über die Innenmembran untersucht. Es konnte eine kurze N-terminale Sequenz von 11 Aminosäureresten identifiziert werden, welche für die Funktionalität der TIM23-Translokase essentiell ist. Die Deletion dieser Sequenz beeinflusst die Integrität der bekannten Untereinheiten der TIM23-Translokase nicht, führt jedoch zu einer starken Beeinträchtigung der Translokation von Präproteinen über die mitochondriale Innenmembran. Durch gezielte Alanin-Punktmutagenese konnten zwei konservierte Aspartatreste in der Tim17-Sequenz identifiziert werden, welche für den Translokationsdefekt verantwortlich sind. Die Analyse weiterer Mutanten in Tim17 mit einzelnen oder wechselseitig ausgetauschten geladenen Aminosäureresten im Intermembranraum legen nahe, dass die konservierten negativen Ladungen in Tim17 mit den positiv geladenen Präsequenzen interagieren und dadurch die Translokation von Präproteinen durch den TIM23-Komplex regulieren. Diese Ergebnisse geben einen Einblick in eine Präprotein-abhängige Regulation der TIM23-Translokase über ein mögliches "Öffnen" und "Schließen" des Translokationskanals via Tim17. Die meisten Proteine der mitochondrialen Innenmembran, die als Präproteine mit mitochondrialen Präsequenzen im Cytosol synthetisiert werden, erreichen die Innenmembran auf einem von zwei alternativen Sortierungswegen: Dem "Stop-Transfer-Weg", auf dem Präproteine während der Translokation durch den TIM23-Komplex arretiert und lateral in die Innenmembran inseriert werden und dem Weg der "Konservativen Sortierung", auf dem die Proteine über Intermediate in der mitochondrialen Matrix in die Innenmembran inseriert werden. Folglich müssen diese Proteine entsprechende Sortierungssignale aufweisen, die entweder die laterale Membraninsertion (Stop-Transfer-Proteine) oder die die Translokation in die Matrix (konservativ sortierte Proteine) durch die TIM23-Translokase vermitteln. Das Sortierungsverhalten von mitochondrialen Innenmembranproteinen mit N-terminalen Präsequenzen, die zunächst für die initiale Translokation des N-Terminus der Proteine sorgen, wird von den Transmembrandomänen bestimmt. Um den Einfluss der Transmembrandomänen auf den Sortierungsweg zu untersuchen, wurden die entsprechenden Domänen von Stop-Transfer sortierten Proteinen und konservativ sortierten Proteinen wechselseitig ausgetauscht. In den chimären Proteinen bestimmten jeweils die eingeführten Transmembrandomänen das Sortierungsverhalten. Eine Untersuchung dieser Transmembrandomänen zeigte zwei systematische Unterschiede: Transmembrandomänen, die die konservative Sortierung vermitteln, weisen eine zumeist moderate Hydrophobizität auf und enthalten zumeist Prolinreste. Dagegen sind Stop-Transfer vermittelnde Transmembrandomänen typischerweise stärker hydrophob und frei von Prolinresten. Die Einführung von Prolinresten in die Transmembrandomänen von ursprünglich Stop-Transfer sortierten Proteinen führte zu deren Translokation in die Matrix. Umgekehrt führte die Mutagenese von Prolinresten in Transmembrandomänen ursprünglich konservativ sortierter Proteine zu deren Arretierung in der Innenmembran. Die Anwesenheit von Prolinresten in den Transmembrandomänen bestimmt demnach den Sortierungsweg dieser Innenmembranproteine. Zukünftige Studien werden zeigen, wie diese Sortierungssignale, welche eventuell eine von Prolinresten gebrochene hydrophobe Helix darstellen, von der TIM23-Translokase erkannt und entsprechend umgesetzt werden. Die Bedeutung von Prolinresten in Transmembrandomänen von konservativ sortierten Proteinen konnte durch Mutagenese sowohl in vitro als auch in vivo gezeigt werden. Diese Erkenntnis sollte sowohl in Vorhersagen von Proteinsortierungswegen als auch bei der zukünftigen Entwicklung mitochondrialer Proteine für gentherapeutische Ansätze zur Behandlung mitochondrialer Erkrankungen berücksichtigt werden.