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Leupold, Jörg (2005): Untersuchungen zur Regulation des Invasionsgens Urokinase-Rezeptor (CD87) durch den Tumorsuppressor Pdcd4 unter gleichzeitiger methodischer Neuetablierung eines quantitativen CAM-Assays. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss des potentiellen Tumorsuppressors Pdcd4 auf das invasionsassoziierte Urokinase-Rezeptorgen(uPAR), sowie auf den Invasionsvorgang selbst, untersucht. In verschiedenen gastrointestinalen Karzinomzelllinien wurde eine gegenläufige Expression von uPAR und Pdcd4-mRNA und -Protein nachgewiesen. In Reportergen-Assays unter Verwendung von Wildtyp- und mutiertem uPAR-Promotor zeigte sich nach gleichzeitiger Transfektion von Pdcd4 eine dosisabhängige Suppression der uPARPromotoraktivität. Ferner wurden verschiedene cis-Elemente innerhalb des Promotors als potentielle Mediatoren dieser Regulation identifiziert. Bei diesen handelt es sich potentiell um die Region -402/-350bp mit mutmaßlichen Bindestellen für Sp-1, GATA-1, NF-1 und einem PEA3/ets Element an Position -245 bp. Zusätzlich konnte durch eine Mutation der kombinierten Bindungstelle für Sp-1 und Sp-3 an Position -152/-135bp, die über Pdcd4 ermittelte Suppression der Promotoraktivität aufgehoben werden. In Gelshiftanalysen zeigte sich neben einer verminderten Bindung von Transkriptionsfaktoren der GATA- und Sp-Familie innerhalb der Region -402/-350bp insbesondere eine Erhöhung der Bindung von Sp-3 an Promotorregion - 152/-135bp. Dies impliziert neben den oben genannten Mediatoren, dass Pdcd4 durch Induktion der Bindung von Sp-3 an dieses Element den uPAR-Promotor supprimiert. Darüber hinaus konnte durch die Expression von Pdcd4 die Invasionsfähigkeit der Kolonkarzinomzellinie HCT-116 in vivo reduziert werden. Diese Ergebnisse zeigen, dass Pdcd4 die Promotoraktivität von uPAR über verschiedene cis-aktive Elemente des Promotors supprimiert und belegen erstmals die Regulation eines invasionsassoziierten Gens durch den potentiellen Tumorsuppressor Pdcd4. Ferner wird erstmals Sp-3 als Mediator der Pdcd4 vermittelten Genexpression vorgeschlagen. Daneben postulieren die Invasionsdaten auch eine Funktion von Pdcd4 als potentiellen Suppressor von Teilschritten der Metastasierungskaskade. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit ein neues quantitatives CAM-Modell etabliert werden, das die Invasion und Intravasation von Tumorzellen in vivo spezifisch im Hühnerei-Modell untersucht. Das Protokoll unterscheidet sich von den bisher publizierten Arbeiten durch die Verwendung einer spezifischen TaqMan®-Probe in Zusammenfassung 116 Kombination mit Primern, die spezifisch humane Alu-Sequenzen der YB8-Unterfamilie nachweisen. Durch diese Modifikationen wurde eine höhere Sensitivität der quantitativen Alu-PCR erreicht. Zusätzlich eröffnet die Spezifität der hier entwickelten Primer über den CAM-Assay hinaus die Möglichkeit, humane Zellen und Mikrometastasen auch in murinen in vivo Modellen wie SCID- oder Nacktmäusen nachzuweisen.