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Moosmann, Andreas (2002): Gezielte Reaktivierung spezifischer zytotoxischer T-Zellen mit Epstein-Barr-Virus-Vektoren. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Die gezielte Generierung antigenspezifischer T-Zellinien, zum Beispiel für den Einsatz in der adoptiven Immuntherapie, erfordert die Stimulation der T-Zellen durch Kokultivierung mit anderen Zellen, die das Antigen in einem geeigneten molekularen Kontext auf ihrer Oberfläche präsentieren. Für den Spezialfall der Stimulation Epstein- Barr-Virus-(EBV)-spezifischer T-Zellen existiert ein besonders effizientes System: EBV-immortalisierte B-Zellen, genannt lymphoblastoide Zellinien (LCLs). Solche LCLs sind leicht für jeden beliebigen humanen Spender herzustellen und proliferieren unbegrenzt. Sie exprimieren mehrere virale Proteine, die in vitro wie in vivo eine starke antivirale T-Zell-Antwort hervorrufen, und stimulieren effizient spezifische T-Zellen gegen diese EBV-Antigene. EBV wurde genetisch modifiziert, um ein neues System zur rationellen Generierung antigenpräsentierender Zellen für die T-Zell-Stimulation ermöglichen. Dieses System beruht auf rekombinanten EBV-Vektoren, mini-EBVs, in die das Gen für ein beliebiges Antigen eingebaut wurde. Mini-EBVs immortalisieren B-Zellen, und in den entstehenden Zelllinien, genannt mini-LCLs, wird das gewünschte Antigen exprimiert. Zudem können mini-LCLs im Gegensatz zu LCLs kein infektiöses EBV bilden und sind daher im Hinblick auf einen therapeutischen Einsatz als besonders sicher anzusehen. In dieser Arbeit sollte die Eignung von mini-LCLs gezeigt werden, effizient ein Fremdantigen zu präsentieren, um antigenspezifische T-Zellen zu restimulieren und expandieren. Schwerpunkt der Arbeiten bilden Untersuchungen mit einem mini-EBVVektor, der als Modellantigen das Gen für pp65 trägt, ein immundominantes T-Zell- Antigen aus dem humanen Cytomegalovirus. Die mini-EBV-Immortalisierung wurde so weit optimiert, daß schließlich bei acht von neun gesunden Normalspendern aus einer kleinen Blutprobe pp65mini-LCLs etabliert werden konnten. Sie waren frei von Wildtyp-EBV, exprimierten intrazellulär pp65 und auf ihrer Oberfläche essentielle Präsentations- und Kostimulationsmoleküle. Durch Restimulation mit der autologen pp65mini-LCL wurden T-Zellinien generiert. Detaillierte Zytotoxizitätsanalysen zeigten die HLA-restringierte, pp65-spezifische Zytotoxizität der pp65mini-LCL-stimulierten T-Zellinien aus vier von vier CMV-seropo-sitiven Spendern. Bei allen diesen T-Zellinien dominierte nach wiederholter Restimulation die pp65-spezifische über die EBV-spezifische Zytotoxizität. T-Zellinien aus EBV-seronegativen Spendern sowie Kontroll-T-Zellinien, die mit Kontroll-mini-LCLs ohne pp65-Expression stimuliert worden waren, zeigten dagegen lediglich eine EBVspezifische Zytotoxizität. Durch Färbung mit HLA:Peptid-Tetrameren wurde die Expansion pp65-epitopspezifischer T-Zellen in allen pp65mini-LCL-restimulierten T-Zellinien aus CMV-seropositiven Spendern nachgewiesen. Bei den drei pp65-T-Zellinien mit einer Kultivierungsdauer von mindestens 50 Tagen, die mit Tetrameren untersucht werden konnten, wurden 40% oder mehr pp65-epitopspezifische CD8+-T-Zellen nachgewiesen. Auch EBV-epitopspezifische Zellen waren nachweisbar, jedoch bestätigten die Tetramer- Analysen, daß durch Restimulation mit pp65mini-LCLs bevorzugt pp65-spezifische T-Zellen expandiert wurden. Der Vergleich mit den Resultaten verschiedener aktuell publizierter Protokolle zur invitro- Generierung pp65-spezifischer T-Zellen für die adoptive Immuntherapie zeigt, daß pp65mini-LCLs ein vorteilhaftes Werkzeug sein werden, um dieses Ziel zu erreichen. Die Erweiterung des mini-EBV-Systems auf andere therapierelevante Antigene ist die Aufgabe der Zukunft.