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Keidel, Eva-Maria (2005): Funktionelle Charakterisierung von FMRP, dem Krankheitsgenprodukt des Fragilen X-Syndroms. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Fragile X syndrome is the most frequent form of heritable mental retardation. In the majority of cases the disease is caused by transcriptional silencing of the FMR1 gene in response to the expansion of CGG repeats in the 5´UTR of the gene, leading to a lack of fragile X mental retardation protein (FMRP). Only a few patients exhibit missense-mutations in the coding region of FMR1 leading to an aberrant gene product. However, little is known about how FMRP deficiency or malfunction leads to the pathophysiology of Fragile X syndrome. FMRP is an RNA binding protein that associates with translating polyribosomes as part of a large messenger ribonucleoprotein (mRNP). In the present study, it was investigated whether the protein can act as a regulator of translation. Using recombinant FMRP, it was shown that the protein suppresses translation of different mRNAs in rabbit reticulocyte lysate. Interestingly, FMRP containing an amino acid substitution at position 304 (FMRPI304N), originally identified in a severely affected patient, renders the protein incapable of interfering with translation. In vitro binding experiments revealed that FMRPI304N, in contrast to wildtype FMRP, was incapable of forming homo-oligomers. However, its affinity for mRNA was not altered. These results suggest that oligomerization is a prerequisite for the function of FMRP in translational inhibition. In order to identify the protein region responsible for homo- and hetero-oligomerization with the two autosomal homologues FXR1 and FXR2, an array of FMRP deletion mutants were tested for oligomerization properties. In vitro binding experiments showed that a putative coiled-coil domain (aminoacids 112 to 215) was required for mutual interaction of all three proteins. Finally, it was examined whether FMRP is post-translationally modified and whether this may play a role in the function of this protein. It was initially demonstrated that both, mammalian cell extract and casein-kinase II, are capable of FMRP phosphorylation in vitro. Furthermore phospho-aminoacid analysis of immunoprecipitated human FMRP revealed phosphorylation of serine residues. Additionally, the protein can be methylated in vitro in the C-terminal part. The outlined experimental strategy may be utilized as a tool for the identification and characterization of FMRP-modifying enzymes. The obtained data identify FMRP as a negative regulator of translation and suggest that misregulation of translation of specific mRNAs lead to the disease phenotype. Analysis of the biogenesis of spliceosomal U-snRNP was the second project of the Ph.D. thesis. This process involves the transient export of nuclear encoded U snRNA to the cytoplasm, the assembly with a set of spliceosomal proteins (termed Sm-proteins B/B’, D1, D2, D3, E, F, and G) and the nuclear import of the assembled particle to the nucleus. The assembly reaction of U-snRNP, although a spontaneous process in vitro, is facilitated in vivo by a large number of proteins, including SMN, the protein mutated in the neuromuscular disorder spinal muscular atrophy. These factors are organised in two functional units, termed PRMT5-complex and SMN-complex, that successively cooperate in the assembly reaction. In a first step, the PRMT5-complex sequesters newly synthesized Sm proteins and converts arginines in SmB, D1 and D3 to symmetrical dimethylarginines (sDMA). This enhances their transfer to the SMN-complex, which facilitates the assembly reaction with the U snRNA. Whereas in vitro methylation experiments have identified PRMT5 as the catalytic component of the PRMT5 complex, the functions of the two known cofactors of this enzyme, pICln and WD45, were unknown. Using a biochemical approach, an interaction map of the PRMT5 complex has been established. These studies revealed that oligomeric PRMT5 directly interacts with pICln and WD45 via distinct domains. Interestingly, in vitro methylation experiments further indicated that both cofactors strongly activate the catalytic activity of the methyltransferase. The transfer of modified Sm proteins to the SMN-complex was studied in a newly established assay system. Sm proteins form stable heterooligomeric complexes composed of SmB/D3, SmD1/D2 and SmE/F/G and it is believed that these complexes are intermediates in the assembly reaction. Quite unexpectedly, the studies presented in this thesis indicate that Sm proteins bind initially as monomers to the PRMT5-complex to allow for the efficient methylation and transfer to the SMN complex. The data suggest that hetero oligomerization takes place in a late step of the assembly reaction, possibly at the SMN complex prior to U snRNP assembly.

Abstract

Das Fragile X-Syndrom ist die häufigste Form vererbter mentaler Retardation. In nahezu allen Fällen wird die Krankheit durch Expansion von CGG-Triplett-Wiederholungen im 5´UTR des FMR1-Gens hervorgerufen: Dies führt zur transkriptionellen Abschaltung des Gens und damit zum Fehlen des fragile X mental retardation protein (FMRP). Darüber hinaus sind wenige Patienten bekannt, die FMR1 mit Mutationen im kodierenden Bereich exprimieren. Welche zellulären Prozesse durch FMRP-Defizienz oder -Fehlfunktion gestört werden, ist bislang unklar. In der vorliegenden Arbeit wurde die Hypothese verfolgt, dass FMRP ein Regulator der Translation ist. Dem lag die Beobachtung zugrunde, dass FMRP einerseits an mRNA-Moleküle binden kann und im Kontext makromolekularer Komplexe mit aktiv translatierenden Ribosomen assoziiert. Mit Hilfe von in-vitro-Translationsexperimenten in Reticulocytenlysaten konnte in der Tat gezeigt werden, dass rekombinant exprimiertes FMRP die Translation unterschiedlicher mRNAs inhibiert. Eine Variante von FMRP mit einer Aminosäureaustausch-Mutation, die in einem Patienten mit schwerem Krankheitsgrad gefunden worden war (I304N), ist hierzu kaum noch in der Lage. Anhand von Protein Bindungsstudien wurde deutlich, dass dem mutierten Protein die Fähigkeit zur Bildung von Homooligomeren fehlt, während seine RNA-Bindungseigenschaften nicht beeinträchtigt sind. Dies zeigt, dass Protein-Oligomerisierung eine Voraussetzung für die Aktivität von FMRP bei der Translationsinhibition ist. Um jene Aminosäuresequenzen in FMRP zu identifizieren, welche für die Bildung von Homo- oder Heterooligomeren (mit den autosomalen Homologen FXR1 und FXR2) verantwortlich sind, wurden in-vitro-Bindungsexperimente mit rekombinant hergestellten Deletionsmutanten aller drei Proteine durchgeführt. Der verantwortliche Bereich konnte auf ein von Aminosäuren 112 bis 215 gebildetes Coiled-Coil-Motiv in FMRP eingegrenzt werden. Schließlich wurde untersucht, ob FMRP posttranslational modifiziert wird und die Aktivität des Proteins auf diese Weise reguliert sein könnte. Zunächst wurde festgestellt, dass rekombinantes FMRP in vitro von Säugerzell-Extrakt bzw. rekombinanter Casein-Kinase II phosphoryliert wird. Durch zweidimensionale Gelelektrophorese von FMRP-Immunpräzipitaten konnte die Phosphorylierung von FMRP auch in vivo gezeigt werden. Die modifizierten Aminosäuren wurden als Serinreste identifiziert. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass FMRP in vitro am C-Terminus methyliert werden kann. Die geschilderten Nachweismethoden können nun für die Identifizierung und Charakterisierung der modifizierenden Enzyme herangezogen werden. Ein zweites Projekt befasste sich mit der Biogenese spleißosomaler U-snRNP. Dieser Prozess erfordert eine Reihe von Proteinen, eine essentielle Komponente ist dabei das Protein SMN, welches bei der neuromuskulären Krankheit Spinale Muskelatrophie (SMA) mutiert ist. SMA ist die zweithäufigste autosomal rezessive Erkrankung mit Todesfolge beim Menschen. Sie wird durch Mutationen im SMN1-Gen verursacht, wodurch es zu einem Mangel an funktionellem SMN-Protein in der Zelle kommt. Das Protein ist eine Komponente in makromolekularen Komplexen, welche die Zusammenlagerung spleißosomaler U-snRNP katalysieren. Eine allen U-snRNP gemeinsame Komponente ist die heptamere snRNP Core Domäne, bestehend aus den Proteinen SmB, D1, D2, D3, E, F, und G. Bevor sie von SMN gebunden und auf die U snRNA transferiert werden können, ist eine symmetrische Dimethylierung von SmB, SmD1 und SmD3 erforderlich, welche vom PRMT5-Komplex katalysiert wird. Während die Funktion der Protein-Arginin-Methyltransferase PRMT5 als katalytisch aktiver Faktor durch in-vitro-Methylierungsassays bereits belegt werden konnte, war die Rolle der beiden cytoplasmatischen Assoziationspartner, pICln und WD45, noch unklar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand zunächst darin, den Aufbau des Komplexes zu untersuchen und die Funktion von pICln und WD45 zu analysieren. Mit Hilfe von in-vitro-Bindungsexperimenten konnte gezeigt werden, dass sowohl pICln, als auch WD45 an PRMT5 binden. PRMT5 ist als zentrale Komponente des Komplexes in der Lage zu oligomerisieren. In unterschiedlichen in vitro Experimenten konnte nachgewiesen werden, dass pICln und WD45 Aktivatoren der Methyltransferase sind. So kann die Methylierungsaktivität von aus Zellextrakt isoliertem, als auch von rekombinant exprimiertem PRMT5 durch Zugabe der beiden Proteine stimuliert werden. Sm-Proteine, welche aus U-snRNP isoliert werden, liegen in heterooligomeren Komplexen vor. Dabei wechselwirken die Sm-Proteine B und D3 (SmB/D3), D1 und D2 (SmD1/D2) und E, F und G (SmE/F/G) miteinander. Unklar war bisher jedoch, in welchem Schritt des Sm Core Assembly diese Assoziationen stattfinden. In vitro Methylierungsassays wiesen darauf hin, dass die Sm-Proteine zum Zeitpunkt ihrer Methylierung durch PRMT5 einzeln und nicht als Heterooligomere bestehen. Weiterhin zeigten Immunpräzipitationen, dass SmB und D3 effektiver auf den SMN-Komplex übertragen wurden, wenn sie nicht als Komplex vorlagen. Diese Daten lassen vermuten, dass sich die Sm-Proteine erst kurz vor dem Sm Core Assembly zu Heterooligomeren zusammenfinden.