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Wu, Chen-ti (2005): Durchflusszytometrische Verfahren zur Beurteilung der Spermaqualität nach einer experimentell induzierten Hyperthermie am Bullenhoden. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

The aim of this study was to examine if the assessments of sperm quality can be better objectified and standardized by using flow cytometric examinations. For this investigation temporary deterioration of sperm quality was induced by a local heating of testes in bulls. The scrotal surface temperature of 4 bulls was increased during the local heating of testis by enclosing the entire scrotum for 48 hours by 6.4°C to 7.1°C. Semen was collected 3 times a week from Day -7 to Day 61 and once a week from Day 68 to Day 83 (Day 0 = the day of scrotal insulation). Each ejaculate was conventionally examined (numbers of total spermatozoa, sperm concentration, morphology and proportion of vital spermatozoa after staining with bromphenol blue nigrosin). The percentage of motile spermatozoa and progressive motile spermatozoa of motile sperm were determined with a computer-assisted motility analysis. Using flow cytometry the proportions of sperm with the following parameters were examined and analyzed: intact plasma membranes after staining with SYBR®14/PI, high mitochondrial membrane potentials after staining with JC1, damaged acrosome status after staining with FITC-PNA/SYTO®17/PI, and sperm with defective chromatin structure or rather with high DNA fragmentation index (DFI) by SCSA. The deterioration of sperm quality after elevating testicular temperature was correspondent to a large extent to the typical changes of the conventional sperm parameters, which result is in agreement with previous similar studies. After testicular hyperthermia (Day 0) changes of sperm quality occurred in the following sequence. There was a notable increase in secondary sperm abnormalities as well as a decrease in sperm motility on Day 9 after testicular hyperthermia. The proportions of vital spermatozoa after staining with bromphenol blue nigrosin, total sperm count and sperm concentration were decreased on Day 12 for the first time. At the same time the primary sperm abnormalities began to increase. The primary abnormalities most frequently encountered were morphological head defects of spermatozoa. Concurrent with the changes specified above the following alterations of sperm parameters were observed with flow cytometry. Beginning on Day 7 after testicular hyperthermia sperm with defective acrosome status increased. From Day 9 on sperm with intact plasma membranes and sperm with high mitochondrial membrane potentials began to decrease. On Day 12 after testicular hyperthermia the proportion of sperm with defective chromatin structure (spermatozoa with high DFI) started to increase significantly. The relationships between the proportions of defective sperm chromatin structure assessed with the SCSATM test and the proportions of sperm head defects were highly significant (r = 0.81; P < 0.0001). The proportion of sperm with a high mitochondrial membrane potential correlated positively to the sperm motility (r = 0.83; P < 0.0001). Significant correlations between the viability assessed by light microscopy and the percentages of spermatozoa with intact plasma membrane obtained by flow cytometry (r = 0.77; P < 0.0001) occurred. The increase of the proportion of the sperm with defective chromatin structure (spermatozoa with high DFI) was more clearly pronounced than that of the morphological abnormal sperm heads. This result indicates that heat stress had led to chromosome defects not only in morphologically abnormal but also in normally appearing sperm cells. In addition, morphological sperm abnormalities, especially sperm head defects, may be indicative of chromosome abnormalities also in normally appearing sperm cells of an ejaculate. This study shows that flow cytometric assessments of the ejaculate is a reliable and objective method in semen investigation. It provides additional important information about the sperm quality. In further studies, it has to be clarified, whether the prospective fertilization capacity from an ejaculate and/or the fertility of a bull can be predicted with this method more reliable than with the conventional sperm evaluation.

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, zu überprüfen, ob mit Hilfe durchflusszytometrisch erfasster Parameter die Beurteilung der Spermaqualität besser objektiviert und standarisiert werden kann. Als Modell für diese Untersuchung wurden Bullen gewählt, bei denen durch eine experimentell herbeigeführte skrotale Hyperthermie eine temporäre Verschlechterung der Spermaqualität herbeigeführt wurde. Die skrotale Oberflächentemperatur von vier Bullen wurde während einer 48-stündigen Hodenerwärmung mittels skrotaler Isolierung um 6,4 °C bis 7,1 °C erhöht. In dem Zeitraum von Tag 7 vor der Hodenerwärmung (Tag 0 = Beginn der Wärmeapplikation) bis zum Tag 61 wurde von den Bullen dreimal pro Woche ein Ejakulat gewonnen und untersucht. In dem verbleibenden Versuchszeitraum bis Tag 83 wurde dieser Vorgang noch einmal pro Woche durchgeführt. Jedes Ejakulat wurde sowohl konventionell (Gesamtspermienanzahl, Konzentration, Morphologie, Anteil vitaler Spermien in der Bromphenolblau-Nigrosin-Färbung) sowie mittels computer-gestützter Spermienmotilitätanalyse (motile Spermien, vorwärtsbewegliche Spermien innerhalb der motilen Spermien), als auch mit der Durchflusszytometrie (Plasmamembranintegrität nach SYBR®14/PI-Färbung, Mitochondrienmembranpotential nach JC-1-Färbung, akrosomaler Status nach FITC-PNA/SYTO®17/PI-Färbung, Spermienchromatinstruktur mittels SCSATM) analysiert und beurteilt. Die nach der Hodenerwärmung eingetretene Verschlechterung der Spermaqualität entsprach weitgehend den in ähnlichen Versuchen beobachteten typischen Veränderungen der herkömmlich verwendeten Spermaparameter. Die Veränderungen bzw. Schädigungen waren in folgender zeitlicher Abfolge zu beobachten. Neun Tage nach testikulärer Wärmeapplikation trat eine deutliche Vermehrung der sekundären Spermienanomalien und ein Abfall der Spermienmotilität auf. Die Spermienvitalität, gemessen am Prozentsatz ungefärbter Spermien nach Bromphenolblau-Nigrosin-Färbung, sowie die Gesamtspermienanzahl und Spermienkonzentration fielen ab Tag 12 nach der Hodenerwärmung ab. Die primären Spermienanomalien, die hauptsächlich von der morphologisch anomalen Spermienköpfe geprägt waren, nahmen ab Tag 12 nach der Hodenerwärmung zu. Zeitgleich zu den oben genannten Veränderungen wurden mit Hilfe der Durchflusszytometrie folgende Veränderungen festgestellt: Ab Tag 7 nach der Hodenerwärmung nahmen die Spermien mit geschädigtem akrosomalen Status zu. Der Prozensatz der Spermien mit intakter Plasmamembran und der Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential fiel ab Tag 9 nach der skrotalen Wärmeapplikation ab. Zwölf Tag nach der Hodenerwärmung stieg der Anteil der Spermien mit erhöhten DFI-Werten signifikant an. Die Beziehungen zwischen den Ergebnissen des mit dem SCSATM-Test ermittelten Anteil der Spermien mit geschädigtem Chromatin und den prozentualen Anteilen der primären Spermienkopfanomalien waren sehr stark ausgeprägt (r = 0,81; p < 0,0001). Der prozentuale Anteil an Spermien mit hohem Mitochondrienmembranpotential korrelierte positiv mit dem prozentualen Anteil an motilen Spermien (r = 0,83; p < 0,0001). Zwischen der lichtmikroskopisch beurteilten Spermienvitalität und dem durchflusszytometrisch erfassten prozentualen Anteil an Spermien mit intaktem Plasmamembran bestanden hochgradige Korrelationen (r = 0,77; p < 0,0001). Der Anstieg der DFI-Spermien war viel deutlicher ausgeprägt als der der morphologisch anomalen Spermienköpfe. Dies Ergebnis lässt darauf schließen, dass die Wärmenoxe nicht nur in den morphologisch anomalen, sondern auch in den normal erscheinenden Samenzellen zu Chromosomenschäden geführt hat und morphologische Spermienanomalien, insbesondere die des Kopfes, Ausdruck von Chromosomanomalien auch in den normal erscheinenden Samenzellen eines Ejakulates sein können. Die hier durchgeführten Untersuchungen zeigten, dass die durchflusszytometrische Beurteilung der Qualität von Ejakulaten mit größeren Qualitätsunterschieden eine zuverlässige und objektive Methode darstellt. Sie liefert in Ergänzung zu der herkömmlichen Spermabeurteilung weitere wichtige Informationen über die Spermaqualität. Ob mit Hilfe dieses Verfahrens das voraussichtliche Befruchtungsergebnis eines Ejakulates bzw. die Fertilität eines Bullen zuverlässiger vorhergesagt werden kann als mit der konventionellen Spermabeurteilung, muss in weiteren Studien geklärt werden.