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Rusu, Laura (2004): Bindung von MARCKS an anionische Phospholipidvesikel, Aggregations- und Transportverhalten von synthetischen Gentransfer-Komplexen: Eine Untersuchung mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wurde mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie (FCS) zum ersten Mal systematisch die Bindung von fluoreszenzmarkierten Peptiden an anionischen Lipidmembranen untersucht. Mit dieser Methode konnten Einzelmolekül-Messungen zur Bindung von myristoyliertem Alanin-reichen C Kinase Substrat, MARCKS (151-175), an unilamellare Vesikel mit einem Durchmesser von 100 nm durchgeführt werden. Die Vesikel bestanden aus dem neutralen Lipid Phosphatidylcholine (PC) und den negativ geladenen Lipiden Phosphatidylserine (PS) oder Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2). Eine Signal/Rausch-Analyse ermöglichte die Bestimmung der Sensitivität und des linearen Messbereichs der Methode. Auf Grund der unterschiedlichen Korrelationszeiten der freien und gebundenen Peptide folgte aus den gemessenen Autokorrelationskurven der prozentuale Anteil des gebundenen Pepids. Die Bindung von MARCKS(151-175) an die anionischen Vesikel wurde für verschiedene prozentuale Anteile von PS und PIP2 gemessen. Sie war umso stärker, je höher der Anteil anionischer Lipide in der Membran und damit die attraktive elekrostatische Wechselwirkung war. Die ermittelten Bindungskonstanten stimmten gut mit den Resultaten überein, die mit etablierten konventionellen Techniken wie NMR, ITC oder Spinmarkierung gewonnen wurden. Die Experimente konnten zeigen, dass mit FCS direkte Messungen von nanomolaren Peptidkonzentrationen möglich sind. FCS stellt eine präzise Methode zur Untersuchung der Wechselwirkung von Peptiden und Proteinen mit Lipidmembranen dar. Im zweiten Teil der Arbeit wurde die Selbstorganisation und das Aggregationsverhalten von verschiedenen synthetischen Gentransfer-Komplexen studiert. Mit der Methode der quantitativen Fluoreszenzmikroskopie wurde die Größenverteilung bestimmt und die Zahl der Plasmide pro Gentransfer-Komplex berechnet. Die Polyplexe stellen im Unterschied zu den Lipoplexen unter den experimentellen Bedingungen ein polydisperses kolloidales System dar. Unter dem Einfluss eines natürlichen Surfactants (Alveofact) war ein umgekehrtes Verhalten zu beobachten. Die Messungen zur Kinetik des kolloidalen Systems erfolgten mit der Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie. Mit dieser Methode wurde der Einfluss der Ionenkonzentration und von Alveofact auf die Aggregationskinetik von verschiedenen positiv geladenen Gentransfer-Komplexen untersucht. Die Experimente zeigten, dass die Geschwindigkeit der kolloidalen Aggregation mit der Ionenkonzentration drastisch zunimmt und die mittlere Zahl der Plasmide pro Komplex als Funktion der Zeit linear ansteigt. Nach der Inkubation mit Alveofact stellten die Polyplexe auch unter physiologischen Bedingungen ein stabiles kolloidales System dar und bestanden im Mittel aus 3-5 Plasmiden. Auch in diesem Fall wurde bei den DNA/Lipofectamine-Komplexen ein anderes Aggregationsverhalten beobachtet. Sie bildeten ohne die Einwirkung von Alveofact unabhängig von der Ionenkonzentration ein stabiles Kolloid und bestanden im Mittel aus nur zwei kondensierten Plasmiden. Dagegen führte die Inkubation mit Alveofact zu einer langsamen kolloidalen Aggregation. Die Lipoplexe erreichten in diesem Fall nach 60 min eine Größe von ~3-4 Plasmiden pro Komplex. Mit Fluoreszenz-Korrelationsspektroskopie wurde das Transportverhalten verschiedener Vesikel und Gentransfer-Komplexe in einem negativ geladenen Polymer-Netzwerk (Mucin) untersucht. Die Größe und die Ladung der Partikel bestimmten die Diffusion durch das Polymer-Netzwerk. Kleinere Durchmesser und höhere negative Ladungen der Vesikel trugen zu einem effektiveren Transport durch das Netzwerk bei. Aus der Diffusionskonstante und der makroskopischen Viskosität der Polymerlösung wurden die Abweichungen von der Stokes-Einstein-Relation berechnet. Das Diffusionsverhalten anionischer Vesikel wurde zum Vergleich auch in einem positiv geladenen Kollagen-Netzwerk studiert. Bei den synthetischen Gentransfer-Komplexen mit positiver Überschussladung wurde auf Grund der Bindung zum Netzwerk ein deutlicher Abfall der Diffusionskonstante als Funktion der Polymer-Konzentration beobachtet. Im Unterschied dazu zeichneten sich die negativ geladenen Komplexe wegen der repulsiven elektrostatischen Wechselwirkung durch einen effektiveren Transport im Mucin-Netzwerk aus. Unter dem Einfluss von Alveofact zeigten die positiv geladenen Komplexe ein ähnliches Transportverhalten wie die negativ geladenen Komplexe. Eine gezielte Beschichtung der Komplexe ermöglichte also einen verbesserten Transport durch das Polymer-Netzwerk, was im Zusammenhang mit einem effizienten Gentransfer von Interesse ist.