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Scheinkoenig, Christine (2005): Untersuchungen zur Kryokonservierung hämatopoetischer Stammzellen aus menschlichem Knochenmark mit Trehalose. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Knochenmark oder periphere Blutstammzellen (PBSC) werden unter anderem für autologe oder, z.B. aus logistischen Gründen, für allogene hämatopoetische Stammzelltransplantationen kryokonserviert. Üblicherweise wird hierfür das Knochenmark 1:1 mit einer 20%igen DMSO – Lösung gemischt und kontrolliert eingefroren. Das frisch aufgetaute Knochenmark–DMSO Gemisch wird dem Patienten bei etwa 4°C infundiert, um eine bei höheren Temperaturen verstärkt stattfindende Zellschädigung durch DMSO zu vermeiden. Diese Transplantationsmethode mit DMSO-kryokonservierten Zellen birgt für den Patienten ein nicht unerhebliches Risiko belastender und selten auch lebensbedrohlicher Reaktionen. Diese können einerseits durch die niedrige Reinfusionstemperatur des Transplantats, andererseits aber auch durch den Gehalt an DMSO im Transplantat hervorgerufen werden. Deshalb wurde in dieser Arbeit das Disaccharid Trehalose im Hinblick auf seine Eignung als mögliche Alternativsubstanz zu DMSO geprüft. Um das Überleben von hämatopoetischen Stammzellen untersuchen zu können, mußten zunächst die optimalen Bedingungen für die Langzeitkultur von frühen hämatopoetischen Vorläuferzellen aus mit DMSO- oder Trehalose-kryokonserviertem Knochenmark untersucht werden. Bei diesen Versuchen zeigte sich, dass sich als Überlebensmatrix in der Langzeitkultur (Feeder-Layer) am besten frisch entnommene und bestrahlte Zellen aus Knochenmarkblut eigneten. Unter Verwendung dieses Feeder-Layers konnte nachgewiesen werden, dass nach einer 5-wöchigen Kultur sowohl DMSO- als auch Trehalose-kryokonservierte Zellen in der Lage waren, im Methylzellulose-Assay Kolonien zu generieren. Sowohl im Hinblick auf die Anzahl, als auch auf den Grad der Differenzierung der im Methylcellulose-Assay gezüchteten Zellen fand sich kein signifikanter Unterschied zwischen Zellen, die primär mit DMSO oder mit Trehalose als Frostschutzsubstanz eingefroren wurden. Nachdem bekannt ist, daß DMSO in vitro eine Komplementaktivierung verursacht und es darüberhinaus Hinweise gibt, daß die Höhe der Komplementaktivierung mit der Häufigkeit und Schwere der bei der Transplantation auftretenden Nebenwirkungen korreliert, untersuchten wir zusätzlich im Radioimmunoassay die Höhe der C3a – Konzentration in mit DMSO- oder Trehalose-tiefgefrorenem Knochenmarkblut. Dieser Assay lieferte jedoch, insbesondere bei mit Trehalose-kryokonservierten Zellen nur schwer reproduzierbare (große Standardabweichung) Ergebnisse, die möglicherweise durch die hohe Viskosität der Trehaloselösung bedingt waren. Deshalb kann mit den hier vorgelegten Ergebnissen keine sichere Aussage bezüglich des Komplement-aktivierenden Potentials von Trehalose getroffen werden. Trotzdem belegen die hier beschriebenen Versuche, daß Trehalose eine vielversprechende Substanz für den Schutz von hämatopoetischen Stammzellen bei der Kryokonservierung ist. Vor dem klinischen Einsatz beim Menschen, sollten jedoch noch Versuche im Tiermodell erfolgen, um die Sicherheit und Effektivität dieses Verfahrens auf eine noch solidere Basis zu stellen.