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Selesi, Drazenka (2004): Diversität und Abundanz des Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO) -Gens cbbL autotropher Bakterien in Agrarböden. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Autotrophe Bacteria sind von zentraler Bedeutung für den terrestrischen Kohlenstoffkreislauf, da sie dem an verfügbaren organischen Kohlenstoffverbindungen armen Boden Biomasse zuführen und einen Beitrag zur Reduzierung des atmosphärischen CO2 leisten könnten. Doch während die autotrophen Prozesse und die daran beteiligten Mikroorganismen in aquatischen Habitaten bereits gut untersucht und verstanden sind, besteht noch erheblicher Forschungsbedarf zur Diversität und Abundanz autotropher Bakterienpopulationen in Böden. In dieser Arbeit sollten zentrale Fragen zur Charakterisierung der autotrophen Gemeinschaften mit Werkzeugen der molekularen mikrobiellen Ökologie bearbeitet werden. Die meisten Prokaryota, die mit CO2 als einzige Kohlenstoffquelle zu wachsen vermögen, fixieren dieses über den Calvin-Benson-Bessham Zyklus. Das Schlüsselenzym dieses Zykluses ist die Ribulose-1,5-bisphosphat Carboxylase/Oxygenase (RubisCO). Die große Untereinheit der Form I-RubisCO wird von dem Gen cbbL kodiert, welches phylogenetisch in zwei Hauptentwicklungslinien unterteilt wird: ‚green-like’ und ‚red-like’. Um einen Einblick in die genetische Diversität CO2-fixierender Bakterien in unterschiedlich gedüngten Agrarböden des Dauerdüngungsversuchs Ewiger Roggenbau in Halle/Saale zu erlangen, wurde eine auf PCR basierende Methodik entwickelt, die auf der Erfassung des Funktionsgens cbbL zielt. Es wurden Datenbankrecherchen durchgeführt und mittels den anschließenden vergleichenden Sequenzanalysen und phylogenetischen Untersuchungen bekannter cbbL-Sequenzen spezifische Oligonukleotid-Primerpaare konstruiert, die ausgewählte cbbL-Sequenzen terrestrischer Bakterien der ‚red-like’ bzw. der ‚green-like’ RubisCO-Linien amplifizieren. Mit Hilfe dieser Primer gelang es cbbL-Genbanken anzulegen, die mittels der Restriktions-Fragmentlängen-Polymorphismus-(RFLP)-Analyse und Diversitätindices untersucht und verglichen wurden; ausgewählte Sequenzen wurden einer phylogenetischen Zuordnung unterzogen. Mit den entwickelten Primerpaaren konnten in den untersuchten Böden nur eine geringe Diversität an ‚green-like’ cbbL-Sequenzen festgestellt werden, die phylogenetisch zu den cbbL-Sequenzen von Nitrobacter vulgaris und Nitrobacter winogradskyi nahe verwandt waren. Im Vergleich dazu zeichneten sich die ‚red-like’ cbbL-Sequenzen aus den Böden durch eine hohe Diversität aus, wobei sie phylogenetisch über die gesamte ‚red-like’-Gruppe verteilt waren und sich häufig als nur entfernt verwandt zu bekannten cbbL-Sequenzen herausstellten. Während mit der RFLP-Analyse Bodenbehandlungs-spezifische Muster identifiziert wurden, war nach der phylogenetischen Sequenzanalyse keine Cluster-Bildung in Abhängigkeit von der Bodenbehandlung zu beobachten. Um den Datensatz an vorhandenen ‚red-like’ cbbL-Sequenzen zu erweitern, wurden cbbL-Gene aus verschiedenen kultivierten α- und β-Proteobacteria sowie aus Bakterienisolaten, die in dieser Arbeit aus Boden gewonnen wurden, amplifiziert. Die phylogenetische Sequenzanalyse gruppierte diese cbbL-Sequenzen Taxon-unabhängig zu den verschiedenen Clustern des ‚red-like’-Baums einschließlich der neuen cbbL-Gencluster aus den Halle-Böden. Bakterielle Bodenisolate, die als cbbL-positiv identifiziert wurden, konnten basierend auf ihrer 16S rDNA-Sequenz als Organismen der Gram-positiven Gattungen Bacillus, Streptomyces und Arthrobacter klassifiziert werden. Vertreter dieser bakteriellen Gruppen waren bisher nicht als CO2-Fixierer charakterisiert worden. Der physiologische Beweis eines aktiven CO2-fixierenden Metabolismus über RubisCO steht noch aus. Die Ergebnisse der ‚red-like’ cbbL-Diversitäts-Studie dienten als Grundlage zur Konstruktion weiterer Oligonukleotide, die in der „real-time“ TaqMan-PCR zur Quantifizierung von ‚red-like’ cbbL-Genen aus Boden eingesetzt wurden. Dabei wird ersichtlich, dass in den untersuchten Bodenvarianten bis zu 107 cbbL-Genkopien/g Boden enthalten sind. Die unterschiedlichen Bodenbehandlungen scheinen keinen Einfluss auf die Abundanz von ‚red-like’ cbbL-Genen in Böden zu nehmen.