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Brachmann, Andreas (2001): Die frühe Infektionsphase von Ustilago maydis: Genregulation durch das bW/bE-Heterodimer. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

The fungus Ustilago maydis is the causative agent of corn smut disease. Prerequisite for successful infection is the fusion of two compatible haploid sporidia and formation of a dikaryon. This process is controlled by the two mating type loci a and b. The a-locus encodes a biallelic pheromone/pheromone receptor system which is responsible for cell-cell recognition and fusion of the sporidia. The subsequent pathogenic development is controlled by the multiallelic b-locus, encoding two homeodomain proteins, bW and bE. After fusion of haploid sporidia, bW and bE proteins from different alleles can form heterodimers, triggering downstream cascades of regulatory processes. These control filamentous growth, penetration of the plant surface, growth inside the plant and induction of galls. The aim of this work was the isolation of genes regulated by the bW/bE heterodimer that play a role during early pathogenic development. For this U. maydis strains were constructed in which bW and bE genes from different alleles can be turned on and off in a regulated fashion. These strains were used in a non-radioactive RNA-fingerprint analysis to identify differences in the transcriptome in response to the formation of the bW/bE heterodimer. The screen covered more than half of all genes transcribed in U. maydis, and 348 amplicons appeared to originate from differentially expressed genes. Further analysis of 48 chosen amplicons led to the identification of 12 previously unknown b-regulated genes. Of those, 7 are upregulated, 5 are downregulated. Therefore the bW/bE heterodimer is a central regulator, triggering a vast change in the transcriptome. For one of the upregulated genes, frb52 encoding a DNA polymerase X homolog, direct regulation by the bW/bE heterodimer could be shown. Deletion of this gene has no effect on mating and pathogenicity, providing no hint as to the role of the protein in these processes. Another upregulated gene encodes a MAP kinase homolog, named Kpp6. Kpp6 has an unusual amino terminal extension of 150 amino acids that exhibits no similarity to any known protein sequence and has no apparent function. kpp6 is not only induced after b-induction, but also shows a different shorter transcript in response to pheromone. Present data indicate that both transcripts encode for the same polypeptide. Deletion of kpp6 leads to a greatly reduced pathogenicity. In infections of corn plants with deletion mutants, no anthocyanin production of the plant is visible, an early defense reaction normally seen in infections with wild-type cells. Therefore Kpp6 has a crucial role in the early infection process and mediates most likely the communication between fungus and plant. Analysis of three of the downregulated genes led to the identification of a cluster of six genes (the cab locus) that are upregulated during phereomone stimulation and shut off after successful cell fusion. Unlike all the other genes known to be upregulated upon pheromone response, this regulation is independent of the transcription factor Prf1. The regulatory role of Prf1 seems to be restricted to the mating type genes, prf1 itself, and genes necessary for pheromone processing or transport. The expression of the cab locus genes is negatively regulated by the pheromone MAP kinase cascade and positively regulated by the cAMP signalling cascade. This antagonistic control points to a differential interaction between the two signalling modules and the processes regulated by the bW/bE heterodimer during different stages of the early infection process.

Abstract

Ustilago maydis ist der Erreger des Maisbeulenbrands. Vorraussetzung für eine erfolgreiche Infektion sind Fusion zweier kompatible Sporidien und Ausbildung eines dikaryotischen Filaments. Diese Prozesse werden durch die beiden Paarungstyploci a und b kontrolliert. Der a-Locus kodiert für ein biallelisches Pheromon/Pheromonrezeptor-System, das die Zell/Zell-Erkennung und die Zellfusion reguliert. Die folgende pathogene Entwicklung wird durch den multiallelischen b-Locus kontrolliert, der für zwei Homeodomänenproteine kodiert, bW und bE. Nach der Fusion der haploiden Sporidien können sich bW/bE-Heterodimere aus bW- und bE-Proteinen unterschiedlicher Allele bilden. Diese regulieren das filamentöse Wachstum, die Penetration der Pflanzenoberfläche, das Wachstum in der Pflanze und die Tumorinduktion. Das Ziel dieser Arbeit lag in der Isolierung von b-regulierten Genen, die eine Rolle während der frühen Infektionsphase spielen. Dazu wurden U. maydis-Stämme erzeugt, in denen eine regulierte Expression von bW und bE verschiedener Allele möglich ist. Diese Stämme wurden in einem nichtradioaktiven RNA-Fingerprint- Ansatz eingesetzt, in dem nach Unterschieden im Transkriptom nach Ausbildung eines bW/bE-Heterodimers gesucht wurde. Dabei wurde mehr als die Hälfte aller in U. maydis transkribierten Gene durchmustert, wobei 348 Amplicons differentiell waren. Die weitere Analyse von 48 ausgewählten Amplicons führte zur Identifikation von 12 neuen b-regulierten Genen. Davon sind 7 induziert und 5 reprimiert. Folglich ist das bW/bE-Heterodimer ein zentrale Regulator, der eine umgreifende Veränderung des Transkriptoms auslöst. Für eines der induzierten Gene, frb52, das für ein DNA-Polymerase-X-Homolog kodiert, konnte eine direkte Regulation durch das bW/bE-Heterodimer gezeigt werden. Die Deletion dieses Gens zeigte keinen Einfluss auf das Kreuzungsverhalten und die Pathogenität, so dass seine Rolle unklar ist. Ein weiteres induziertes Gen kodiert für ein MAP-Kinase-Homolog, das mit Kpp6 bezeichnet wurde. Kpp6 besitzt einen ungewöhnlichen zusätzlichen N-Terminus von 150 Aminosäuren, der keine Ähnlichkeit zu bekannten Proteinsequenzen aufweist, und dem bislang keine Funktion zugewiesen werden konnte. kpp6 ist nicht nur b-induziert, sondern weist auch ein kürzeres, pheromoninduziertes Transkript auf. Die gegenwärtigen Daten deuten darauf hin, dass beide Transkripte für das gleiche Protein kodieren. Die Deletion von kpp6 führt zu einer dramatisch reduzierten Pathogenität. Bei Infektion von Maispflanzen mit Deletionsmutanten tritt keine primäre Anthocyanbildung auf, eine frühe Abwehrreaktion der Pflanze, die bei Infektion mit Wildtyp-Stämmen zu beobachten ist. Kpp6 spielt demnach eine entscheidende Rolle in der frühen Infektionsphase und ist wahrscheinlich an der Kommunikation zwischen Pilz und Pflanze beteiligt. Die Analyse von drei der reprimierten Gene führte zur Identifizierung eines Locus von sechs Genen (dem cab-Locus), die alle pheromoninduziert sind und nach der Zellfusion reprimiert werden. Im Unterschied zu allen anderen bislang bekannten pheromoninduzierten Genen ist die Regulation dieser Gene unabhängig von Prf1. Die regulatorische Rolle von Prf1 scheint auf die Paarungstypgene, prf1 selber und Gene, die für die Reifung oder die Sekretion der Pheromone benötigt werden, beschränkt zu sein. Die Expression der Gene des cab-Locus unterliegt einer negativen Kontrolle durch die das Pheromonsignal übermittelnde MAP-Kinasekaskade und einer positiven Kontrolle durch die cAMPKaskade. Diese antagonistische Regulation weist auf eine differentielle Interaktion zwischen beiden Signalmodulen und den durch das bW/bE-Heterodimer kontrollierten Prozessen während der verschiedenen Stadien der frühen Infektionsphase hin.