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Hopt, Alexander (2004): Biophysikalische Untersuchungen zur physiologischen Bedeutung des Prionproteins als Metalloprotein. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Além da doença de Creutzfeld-Jakob, ìons de cobre tem uma função importante na pathogenese de várias outras doenças neurodegenerativas, por exemplo M. Wilson, M. Alzheimer. Até agora não exisitia nenhuma método para determinar a concentração desde catíon em vivo. Por isso, a minha tése queria achar uma possibilidade para medir cobre por meio de um microscópio ou espetrômetro para seguir a corrente de cobre durante uma depolarisação. O sucesso do uso de corantes fluorescentes para a determinação de concentrações de cálcio nos últimos anos nos encorajou procurar uma substancia que pode detetar especificamente íons de Cu2+. Encontramos que a emissão de TSPP (tetrakis-(4-sulfophenyl)porphine) na região de 645 nm reage muito específico na presença de Cu2+ (KD = 0.43 ± 0.07 µM com pH 7.4). Ela não monstra nenhuma reação com os outros maiores catíons no cérebro, Ca2+ e Mg2+, ao contrário a emissão da maioría das substancias analisadas diminuiu. Também, Zn2+ afeta a fluorescença de TSPP, em outra régião do espétro (605 nm) com uma constante de dissociação KD = 50± 2.5 µM (pH = 7.0). Com TSPP, monstramos primeira vez que existe uma libertação sinaptosomal de cobre depois de depolarisação. Além disso, nós comparamos a quantidade de cobre libertada em camundongos sem (WT) e com (PrP0/0) a deficiência de exprimir o proteina prion (responsável pela doençã de Creutzfeld-Jakob). Achamos a mesma quantidade de vesiculas libertadas em consequência de depolarisação (medido com a corante FM 1-43), mas uma redução significante na quantidade de cobre libertada dos camundongos Prnp0/0. Os resultados foram confirmados de outro método independente, que se chama ICP-MS (inductively-coupled-plasma mass-spectrometry). Com os resultados experimentais, presentamos na tése também uma teoria que pode descrever a função do prion: Assumimos que esta proteína toma o cobre, que sai durante a depolarisação, e leva-o para o interior da célula, não havendo perda. A perda de cobre na ausência do prion seja também uma explicação do processo de CJD.

Abstract

Cu2+-ions are thought to play an important role in the pathogenesis of several neurodegenerative diseases, like Wilson’s, Alzheimer’s and probably Creutzfeld-Jakob’s disease. Until now no method has existed to determine the concentration of this cation in vivo. The successful use of fluorescent dyes for the determination of Ca2+-concentrations in recent years encouraged us to seek a fluorophore which specifically reacts to Cu2+-ions and to characterize it for our purposes. We found that the emission of TSPP (tetrakis-(4-sulfophenyl)porphine) at a wavelength of 645 nm is highly specific to Cu2+ (KD = 0.43 ± 0.07 µM with pH 7.4). It does not react with the most common cations in the brain, Ca2+ and Mg2+, unlike most of the other dyes examined. In addition, Zn2+ quenches TSPP fluorescence at a different emission wavelength (605 nm) with a KD of 50 ± 2.5 µM (pH = 7.0). With TSPP, we show for the first time that there is release of copper by synaptosomes upon depolarisation. Further we compared the amount of released copper between prion-protein-knockout-mice (Prnp0/0) and wild-type mice. While a similar amount of exocytosis was observed (measured with FM 1-43), we observed a significant reduction in the amount of Cu2+ released from Prnp0/0 mice synpaptosomes. These findings were confirmed by ICP-MS (inductively-coupled-plasma mass-spectrometry) and put into a theoretical framework.

Abstract

Im Rahmen dieser Arbeit wird die Rolle des Prionproteins (PrP) als metallbindendes Protein an der synaptischen Plasmamembran analysiert. Hierzu werden i.w. drei Probleme bearbeitet: 1) Es werden Methoden entwickelt, welche es erlauben, Konzentrationen im Bereich ei-niger µM von verschiedenen Metallen (Cu, Zn, Fe, Mn, Co, Ni) in vivo in der Synapse zu bestimmen. Geeignete Methoden dieser Art sind bisher nicht verfügbar gewesen und werden hier erstmals beschrieben. 2) Diese Methoden werden auf ein biologisches System angewandt, um die ausgeschütte-te Menge der Metallionen bei Depolarisation und deren Konzentration in den synapti-schen Vesikeln zu bestimmen. Dazu müssen zusätzliche Techniken verwendet werden, um die Anzahl an ausgeschütteten Vesikeln pro Synapse zu ermitteln. 3) Schließlich werden die ausgeschütteten Mengen zwischen normalen Wildtyp- (WT), Prionprotein-Knockout- (Prnp0/0) und verschiedenen anderen transgenen Mäusen ver-glichen. Bei letzteren ist auf dem Hintergrund der Prnp0/0-Maus das gesamte Prionpro-teingen wieder eingebracht worden (Tg20) bzw. ein um die kupferbindende Domäne verkürztes Prionproteingen eingebracht worden (C4). Anhand dieser Ergebnisse wird eine Theorie zur Funktion des Prionproteins als Metalloprotein an der Synapse disku-tiert. Von den aufgeführten Metallionen sind insbesondere Kupferionen interessant, da sie mit der Pathogenese von verschiedenen neurodegenerativen Krankheiten in Zusammenhang gebracht werden, wie dem M. Menke, M. Wilson (DiDonato und Sarkar, 1997), M. Alzheimer (Wag-goner et al., 1999; Lovell et al., 1998), M. Parkinson und der amyotrophen Lateralsklerose (Waggoner et al., 1999), sowie der Erkrankungsgruppe der spongiformen Enzephalopathien, z.B. der Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (Brown et al., 1997a). Bisher bestand allerdings keine Möglichkeit, im Hirn physiologische Kupferausschüttungen in vivo und quantitativ zu bestimmen. Methodisch wird folgendermaßen vorgegangen: 1) Zum einen wird hier erstmalig ein Fluoreszenzfarbstoff zur In-vivo-Messung der Aus-schüttung von Cu eingesetzt: Durch Bestimmung der Dissoziationskonstanten von sieben Fluoreszenzfarbstoffen (Ca-Green-1, Calcium Crimson, Fluo-3, Fura Red, Phen Green, TCPP, TSPP) mit zehn Metallionen (Fe3+, Ca2+, Mg2+, Co2+, Cd2+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, Na+, K+) ist TSPP (Tetrakis-4-Sulfophenyl-Porphyrin) als ein Farbstoff identifiziert worden, dessen Fluo-reszenz sich spektroskopisch bei 645 nm Wellenlänge spezifisch und sensibel (Disso-ziationskonstante KD = 0,43 ± 0,07 µM bei pH 7,4) in Anwesenheit von Kupfer verän-dert und weder neurotoxisch noch zellpermeabel ist. Parallel dazu erlaubt es TSPP, auf einer zweiten Emissionslinie (605 nm) die Konzentration von Zink (KD = 50 ± 2,5 µM bei pH = 7,0) zu messen. Zum anderen kommt als weiteres Verfahren die Massenspektrometrie (inductively-coupled-plasma mass-spectrometry, ICP-MS) zur Anwendung, um in vivo die Aus-schüttungen der Metalle Cu, Zn, Fe, Mn, Co und Ni zu bestimmen. 2) Als biologisches System werden Synaptosomen gewählt, welche aus Mäusehirnen durch ein spezielles Verfahren präpariert werden. Deren Depolarisation wird zum ei-nen direkt im Fluoreszenzphotometer mit TSPP untersucht. Zum anderen werden sie depolarisiert, die Lösung zentrifugiert und der Überstand mit ICP-MS analysiert. Zur Quantifizierung der Anzahl ausgeschütteter Vesikel pro Synaptosom werden Mes-sungen der Glutamatausschüttung im Photometer und Messungen der intrazellulären Kalziumkonzentration mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2-AM durchgeführt. Erst-mals werden hier auch Messungen der Membranvergrößerung durch Exozytose mit dem Fluoreszenzfarbstoff FM 1-43 bei Synaptosomen angewendet. 3) Für die Präparation der Synaptosomen werden die Maustypen WT, Prnp0/0 (keine Ex-pression von Prionprotein), Tg20 (Überexpression von Prionprotein) und C4 (Expres-sion eines um die kupferbindende Domäne des Prionproteins verkürzten Proteins) verwendet. Die Ergebnisse werden verglichen. Man erhält folgende Ergebnisse: 1) Mit TSPP wird hier erstmals festgestellt, dass WT-Synaptosomen bei Depolarisation physiologisch vorhandenes Cu ausschütten. Für die gleichzeitig gemessene Menge der Zn-Ausschüttung finden sich ähnliche Wer-te in der Literatur. 2) Bei der Analyse mit ICP-MS beobachtet man bei WT-Mäusen statistisch signifikante, depolarisationsbedingte Ausschüttungen von Cu, Fe und Zn, während sich die Werte von Mn, Ni und Co nicht wesentlich verändern. Die Ergebnisse für Cu liegen dabei etwas höher als die mit TSPP gemessenen Konzentrationen. 3) Die Glutamatausschüttung, die intrazelluläre Kalziumkonzentration, sowie die Anzahl der ausgeschütteten Vesikel unterscheidet sich bei keinem der genannten transgenen Maustypen. Weder die basale Kalziumkonzentrationen, noch deren Veränderung durch Kalzium-Einstrom bei der Depolarisation zeigen signifikante Unterschiede. 4) Nur die Ausschüttungsmenge von Kupfer, nicht jedoch die der anderen Metalle, ist abhängig von den gewählten transgenen Maustypen: Sie ist in Prnp0/0-Mäusen vergli-chen mit der von WT-Mäusen bei beiden Messmethoden (TSPP und ICP-MS) um die Hälfte reduziert. Bei der transgenen Linie, welche ein um die kupferbindende Domäne verkürztes Prionprotein überexprimiert (C4), werden Werte gemessen, die der Prnp0/0-Maus entsprechen. Demgegenüber zeigt die transgene Linie, die das gesamte Pri-onprotein überexprimiert (Tg20), Werte, die den Wildtypkontrollen entsprechen . Die vorliegenden Ergebnisse erlauben es, die Konzentration von Kupfer in den synaptischen Vesikeln abzuschätzen. Sie beträgt z.B. für WT-Mäuse ungefähr 67 ± 7 µM bei Messung mit TSPP und 291 ± 75 µM bei Messung mit ICP-MS. Die bei der Ausschüttung entstehende Kupferkonzentration in der Synapse ist demgegenüber wesentlich niedriger. Hier liegen die Werte unter den neurotoxischen Konzentrationen aus Brown et al. (1998d). Die bei den beiden Methoden festgestellten, unterschiedlichen Messwerte für die Ausschüt-tungsmenge an Kupfer lassen sich damit erklären, dass man mit TSPP nur freie, mit ICP-MS aber zusätzlich auch gebundene Kupferionen messen kann. Ferner unterscheidet die ICP-MS nicht zwischen der Valenz des Kupfers, während die Fluoreszenz von TSPP nur durch Cu2+ wesentlich beeinflusst wird. Aus den Ergebnissen lässt sich folgendes schließen: 1) Da die Konzentration des Kupfers in den synaptischen Vesikeln bei allen Maustypen über der durchschnittlichen Kupferkonzentration im Synaptosom liegt (Herms et al., 1999), scheint es einen Transport in die synaptischen Vesikel gegen den Konzentrationsgradien-ten zu geben. 2) Die PrP-Expression scheint über eine Beeinflussung der Kupferkonzentration in den sy-naptischen Endungen bzw. Vesikeln, nicht jedoch über eine Veränderung der Anzahl ausgeschütteter Vesikel die Kupferausschüttung von Synapsen zu verändern. Denkbar ist, dass PrP in diesem Zusammenhang als Puffer für Kupferionen an der synap-tischen Plasmamembran dient, wo Kupfer bei der synaptischen Vesikelfreisetzung in ho-hen Konzentrationen anfällt. Das Prionprotein würde damit der Diffusion der Kupferio-nen in den synaptischen Spalt entgegenwirken und dessen Wiederaufnahme in das präsy-naptische Zytosol ermöglichen. Ob PrP in Anwesenheit von Kupfer verstärkt endozytiert wird (Brown et al., 1997a; Pauly und Harris, 1998) oder ob das an PrP gebundenen Kup-fer über andere Transportwege wieder in das präsynaptische Zytosol gelangt, ist nicht ge-klärt. Offensichtlich jedoch moduliert die Expression des Prionproteins die synaptische Kupferhomöostase.

Abstract

Íons de cobre próbablemente tiene una funcción importante en la pathogenese de várias enfermedades neurodegenerativas, por exemplo M. Wilson, M. Alzheimer y la enfermedad de Creutzfeld-Jakob. Hasta ahora no exisitia ninguna método para determinar la concentración de este catíon en vivo. El sucesso del uso de colorantes fluorescentes para la determinación de concentraciones de cálcio en los últimos años encorajó nosotros para procurar una substância que puede detectar especificamiente íons de Cu2+. Encontramos que la emissión de TSPP (tetrakis-(4-sulfophenyl)porphine) en la región de 645 nm reage muy específico en la presencia de Cu2+ (KD = 0.43 ± 0.07 µM con pH 7.4). Ela no muestra ninguna reacción con los otros maiores catíons del cérebro, Ca2+ y Mg2+, al contrário la emissión de la maioría de las substâncias analisadas tiene diminuido. Tambien, Zn2+ afecta la fluorescencia de TSPP, en otra régión del espéctro (605 nm) con una constante de dissociación KD = 50± 2.5 µM (pH = 7.0). Con TSPP, muestramos primera vez que existe una libertación sinaptosomal de cobre despues de depolarisación. Además, nosotros comparamos la cuantidad de cobre libertada en ratones sin (WT) y con (PrP0/0) la deficiência de exprimir el proteína prion (responsáble por la enfermidad de Creutzfeld-Jakob). Hallamos la mesma cuantidad de vesiculas libertadas en consequência de depolarisación (medido con la colorante FM 1-43), pero una reducción significante en la cuantidad de cobre libertada de los ratones Prnp0/0. Los resultados foran confirmados de otro método independente, que se llama ICP-MS (inductively-coupled-plasma mass-spectrometry).

Abstract

Ions de cuivre probablement ont une function importante dans la pathogenèse de quelques maladies neurodegeneratives, pour exemple M. Wilson, M. Alzheimer et la maladie de Creutzfeld-Jakob. Jusqu'au présent n'ai rien exisiti pour determiner la concentration de ce cation en vivo. Le succès d'usage de colorants fluorescents pour la determination de concentrations de calcium dans les ans récents a nous encouragé pour chercher une substance que peux détecter especifiquement ions de Cu2+. Trouvons que l'emission de TSPP (tetrakis-(4-sulfophenyl)porphine) en la region de 645 nm réage trés especifiquement dans la presence de Cu2+ (KD = 0.43 ± 0.07 µM avec pH 7.4). Elle ne montre rien de reaction avec les outres cations communs cérébrals, Ca2+ et Mg2+, au contraire la emission de la majorité des substances analisées a diminui. Aussi, Zn2+ afecte la fluorescence de TSPP, en outre région du spéctre (605 nm) avec une constante de dissociation KD = 50± 2.5 µM (pH = 7.0). Avec TSPP, montrons la première fois que existe une libertation synaptosomale de cuivre après de depolarisation. En outre, nous comparons la quantité de cuivre liberté dans souris sans (WT) et avec (PrP0/0) la déficience de la expression de la protéine prion (responsable pour la maladie de Creutzfeld-Jakob). Trouvons la même quantité de vesicules libertées en consequence de la depolarisation (mesuré avec le colorant FM 1-43), mais une reduction significante de la quantité de cuivre liberté dans les souris Prnp0/0. Les resultés sont confirmés de outre métode independente, que s'appelle ICP-MS (inductively-coupled-plasma mass-spectrometry).