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Wolff, Michael (2004): Identifizierung und Charakterisierung von Interaktionen der Nichtstrukturproteine NS1 und NS2 des Respiratorischen Synzytialvirus mit Proteinen der Wirtszelle. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Among the Paramyxoviridae, only members of the subfamily Pneumovirinae like Respiratory Syncytial Virus (RSV) encode two nonstructural proteins, NS1 and NS2. These two proteins cooperatively mediate type I interferon resistance and prevent induction of interferon in infected cells. Interactions of NS1 and NS2 proteins in every combination were shown by using the yeast-two-hybrid system. Therfore, NS1 and NS2 are able to form homo- and hetero(oligo)mers in infected cells. Although RSV replicates exclusively in the cytoplasm, NS-Proteins are localized in the cytoplasm as well as in the nucleus. Expression of an enlarged NS1 fusion protein, EGFP-NS1-BRSV N, resulted in the same nuclear and cytosolic localisation indicating that nuclear localisation is not due to diffusion but rather to an active transport. Thus, NS-Proteins should have particular functions in the nucleus of infected cells. Furthermore, yeast-two-hybrid screening of a lung cDNA expression library using NS1 of bovine RSV (BRSV) as a bait, identified cDNA clones encoding several nuclear proteins and one cytosolic protein. BRSV NS2 protein and NS-Proteins from other pneumoviruses (HRSV, PVM) were also able to interact with the identified cellular proteins in yeast. The isolated cDNAs encode the nuclear proteins CDK4BP (p34SEI-1 or TRIP-Br1), RanBP16, MM-1, DEAD Box Helicase p68 and the cytosolic β-COPI. Specific interactions were determined by mutational analysis of BRSV NS1 in yeast. Co-immunoprecipitation from lysates of eukaryotic cells confirmed the interaction of both BRSV NS-Proteins with the cellular proteins. The interaction of MM-1 and p68 with both NS-Proteins was also shown in GST pull down assay in vitro. Engineered BRSV encoding a truncated p68 showed accelerated replication in MDBK and Vero cells, whereas growth of NS1/NS2 deletion mutants expressing the truncated p68 was unaffected. This indicates that the presence of NS-Proteins is a prerequisite for the acceleration of BRSV growth by truncated p68. Furthermore, replication of BRSV was attenuated on HeLa cells in which expression of p68 was knocked down by specific siRNA, whereas replication of the unrelated Rabies virus was not. Thus, p68 is a nuclear target protein for the NS-Proteins and supports BRSV replication in vitro. Growth and division of host cells is necessary for optimal BRSV replication and like p68, most of the identified nuclear protein interactors are related to regulation of the cell cycle and cell division, respectively. Therefore, NS-Proteins appear to influence the cell cycle for optimal replication of BRSV by targeting such proteins. Hence, with the yeast-two-hybrid system, the first cellular interaction partners were identified indicating new functions of NS-Proteins in the viral replication cycle.

Abstract

Pneumoviren wie das Respiratorische Synzytialvirus (RSV) kodieren im Gegensatz zu allen anderen Vertretern der Familie Paramyxoviridae zwei Nichtstrukturproteine, NS1 und NS2. Beide Proteine vermitteln kooperativ Resistenz gegenüber Typ I Interferon und verhindern die Induktion von Interferon in infizierten Zellen Mit Hilfe des „Yeast Two Hybrid“ Systems wurden Interaktionen der NS-Proteine untereinander in allen Kombinationen demonstriert. Somit können die NS-Proteine als Homo- und Heterodimere (bzw. Oligomere) in infizierten Zellen vorliegen. Obwohl RSV ausschließlich im Zytoplasma infizierter Zellen repliziert, sind die NS-Proteine sowohl im Zytoplasma als auch im Nukleus lokalisiert. Die nukleäre Lokalisation ist auf einen aktiven Transport und nicht auf Diffusion in den Nukleus zurückzuführen, wie mit Hilfe eines EGFP-NS1-N Fusionskonstrukts in dieser Arbeit gezeigt wurde. Dieser Befund unterstreicht die funktionelle Bedeutung der Kernlokalisation der NS-Proteine. Weiterhin wurden aus einer cDNA Expressionsbibliothek aus Lungengewebe erstmals cDNA Klone verschiedener nukleärer Proteine sowie eines zytoplasmatischen Proteins isoliert, die mit den NS1 und NS2 Proteinen des bovinen RSV (BRSV) und den NS-Proteinen anderer Pneumoviren (HRSV, PVM) interagieren. Hierbei handelt es sich um die Kernproteine CDK4BP (p34SEI-1; TRIP-Br1), RanBP16, MM-1, die DEAD Box Helikase p68 sowie das zytoplasmatisch lokalisierte β-COPI. Die Spezifität der Interaktionen wurde in Hefezellen durch differentielle Bindung an NS1 Mutanten demonstriert. Durch Ko-Immunpräzipitationen aus Lysaten eukaryotischer Zellen wurden die Interaktionen bestätigt. GST pull down Experimente lieferten eindeutige Hinweise auf eine direkte und spezifische Interaktion der NS-Proteine mit MM-1 und p68. Rekombinante BRS-Viren, die eine verkürzte Form des p68 exprimieren, replizierten in MDBK und Vero Zellen wesentlich schneller als wildtyp-BRSV. BRSV NS1/NS2-Deletionsmutanten mit zusätzlichen p68 RNAs replizierten dagegen wie BRSV∆NS1/NS2, sodass die Synthese der NS-Proteine Voraussetzung für die verbesserte Replikation durch p68 ist. siRNA Experimente zeigten, dass eine verminderte p68 Konzentration in infizierten Zellen zu einer deutlichen Attenuierung des BRSV führen. p68 wurde somit als ein zelluläres Zielprotein für virale NS-Proteine identifiziert, das die BRSV Replikation unterstützt. Wachstum und Teilung der Wirtszellen ist eine Voraussetzung für die optimale BRSV-Replikation in vitro. Da die identifizierten Kernproteine direkt mit der Regulation des Zellzyklus bzw. der Genregulation in Verbindung gebracht werden, kann von einer Beeinflussung der Zellteilung bzw. des Zellwachstums durch die NS-Proteine ausgegangen werden. Das „Yeast Two Hybrid“ System lieferte somit Hinweise auf bisher unbekannte Funktionen der RSV NS-Proteine.