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Holzinger, Jörg (2002): Untersuchung der Reaktionszyklen von Chaperoninen aus Escherichia coli und Thermoplasma acidophilum mit Hilfe der Neutronenkleinwinkelstreuung. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Untersuchung der Reaktionszyklen von Chaperoninen aus Escherichia coli und Thermoplasma acidophilum mit Hilfe der Neutronenkleinwinkelstreuung Am Thermosom wurden bisher noch keine Komplexe untersucht. Hier war von großem Vorteil, daß bei SANS kein Strahlenschaden auftritt und damit Proben modifiziert und anschließend noch einmal gemessen werden konnten. a) b) c) Abbildung 5.2: schematische Darstellung verschiedener Thermosom-Konformationen: a) offenen Konformation, b) geschlossene Konformation c) Bullet-Konformation Ergebnisse Ergebnisse zu GroE - Zum Verständnis der allosterischen Wechselwirkungen innerhalb von GroEL wurde die Lösungsstruktur einer „single-ring“-Mutante von GroEL untersucht. Die Strukturen von apo-single-ring-GroEL und ADP-Komplexen aus protoniertem singlering- GroEL und protoniertem GroES unterscheiden sich nicht oder nicht meßbar von den entsprechenden Strukturen im Kristall. Bei einer Messung mit ADP-Komplexen aus unsichtbarem single-ring-GroEL und sichtbarem GroES wurde dagegen in der Lösungsstruktur eine im Kristall nicht vorhandene Konformationsänderung von GroES beobachtet. Dies bestätigt frühere mit wild-type GroEL durchgeführte Versuche. - Symmetrische Komplexe aus GroEL und GroES, sogenannte Football-Komplexe, werden als wichtiger Zwischenschritt im GroE-Reaktionszyklus diskutiert. In Anwesenheit von AMP-PNP konnten Football-Komplexe aus protoniertem, gematchtem GroEL und deuteriertem GroES nachgewiesen werden. In der Neutronenstreuung zeigen diese Komplexe eine charakteristische Hantelstruktur. Die beiden GroES-Moleküle haben einen Abstand von ca. 200Å (siehe Pfeil in Abb. 5.1c). Mit einer Titratonsreihe konnten wir die Dissoziationskonstante des zweiten GroES-Heptamers in diesen Komplexen mit einem Wert von 2×10-7M bestimmen. - Der Phage T4 hat ein Gen für ein eigenes Co-Chaperonin, GP31, das eine starke Analogie zu GroES aufweist. Wir verglichen die beiden Co-Chaperonine, um zu verstehen, warum GP31 lebenswichtig für den Phagen ist. Aus GroEL und GP31 wurden dazu in Anwesenheit von AMP-PNP Football-Komplexe gebildet. Bei diesen Komplexen ist das Co-Chaperonin etwa 5Å weiter vom Zentrum des Gesamtkomplexes entfernt, als im Fall der GroEL-GroES-Komplexe. Dieses Ergebnis unterstützt die These, GP31 sei nötig, um für die Faltung des Phagenproteins GP23 einen größeren Anfinsen-Cage zu schaffen. GP31 scheint unter vergleichbaren Bedingungen stärker zur Bildung von Football-Komplexen zu neigen als GroES. Bei der Bindung an GroEL ändern GP31 und GroES ihre Konformation. - In Verdrängungsversuchen wurde das Bindungsverhalten von GroES und GP31 an GroEL untersucht. Hierzu wurden mit Hilfe von ADP-Komplexen aus sichtbarem GroEL mit sichtbarem Co-Chaperonin vorgeformt. Das sichtbare Co-Chaperonin wurde dann mit unsichtbarem GroES verdrängt, so daß in den neugebildeten Komplexen nur noch GroEL ein Streusignal gab. Die beobachteten Zerfallsreaktionen mit Halbwertszeiten in der Größenordnung von Stunden lassen sich mit zwei Exponentialfunktionen beschreiben. Dies ist ein Indiz für das Auftreten von verschiedenen Populationen an GroEL-Co-Chaperonin-Komplexen. In allen Fällen waren die Dissoziationsraten bei den GroEL-GP31-Komplexe geringer als bei GroEL-GroES-Komplexen. Komplexe von GroEL mit GP31 sind also stabiler als solche mit GroES. - Bei einer Reihe von Versuchen mit GroEL und Substratprotein (MPB-Y283D) konnten unter anderem 1:2 Komplexe aus GroEL und Substrat und Trans-Komplexe aus GroEL, GroES und Substrat nachgewiesen werden. Diese Experimente zeigten übereinstimmend einen Abstand von 60Å des MPB zum Zentrum von GroEL. Wegen der notwendigen Denaturierung von MBP und anderen Substratproteinen wurden jedoch die Streukurven sehr häufig von Aggregaten gestört. SANS-Experimente mit Substratprotein sind daher wesentlich schwieriger als Versuche mit GroES oder GP31. Ergebnisse zum Thermosom - Die geschlossene Konformation von Thermosom in der Kristallstruktur rührt nicht von der Bindung von Mg-ADP-AIF3 her, sondern vom für die Kristallisation verwendeten Ammoniumsulfat . In Anwesenheit von ADP mit 2M Phosphat, schließt sich das Thermosom auch in physiologischem Puffer. Durch die hohe Phosphat- Konzentration ist davon auszugehen, daß sich in den Nukleotidbindungstaschen des Proteins neben ADP freie Phosphat-Ionen befinden. Die Konformation entspricht also dem Zustand unmittelbar nach der ATP-Spaltung. Wird die Probe auf 50°, die physiologische Temperatur von T. acidophilum, erwärmt, schließt sich das Thermosom in Anwesenheit von ATP. In Kombination mit den Messungen an anderen Thermosom-Nukleotid-Komplexen konnten damit Zwischenzustände im strukturellen Reaktionszyklus des Chaperonins charakterisiert werden. - Bei einer Reihe von Pufferbedingungen wurde die Bildung von Komplexen höherer Ordnung beobachtet. Von anderen Autoren war aufgrund von EM-Arbeiten vorgeschlagen worden, daß Thermosom kein Chaperonin, sondern ein Baustein des Cytoskeletts ist (Trent et al., 1997, 1998). Für die von uns gefundenen Strukturen sind Thermosom-Filamente jedoch keine befriedigenden Modelle. Da sich diese Komplexe höherer Ordnung in der Lösung außerdem bei einer Annäherung an physiologische Bedingungen auflösen, kann davon ausgegangen werden, daß sie in vivo nicht relevant sind. methodische Ergebnisse - Es wurde gezeigt, daß GroEL und GroES einen sehr homogenen Deuterierungsgrad haben, wenn die Bakterien vor der Reinigung unter gut kontrollierten Wachstumsbedingungen im Fermenter gezogenen werden. Das Protein erscheint dann in Kontrastausgleichsexperimenten im geeigneten Puffer, in unserem Fall nahe 99% D2O, als unsichtbar. - In einer Reihe von „stopped-flow“-Messungen wurde gezeigt, daß mit SANS (bei einer Aufsummierung von Daten mehrerer Messungen) grundsätzlich eine Zeitauflösung bis in den Sekundenbereich bei Experimenten an GroEL oder vergleichbar großen Molekülen möglich ist. Um biologisch relevante Ergebnisse erreichen zu können, ist jedoch weitere Arbeit an der Instrumentierung, speziell der Mischapparatur nötig.