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Engmann, Christine (2004): Untersuchungen zur Melatoninrhythmik beim Hausschwein (Sus scrofa f. domestica) unter Anwendung einer neu entwickelten HPLC-Methode. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

The existence of a melatonin rhythm in the domestic pig with respect to the light intensity has been discussed controversally. These controversial results are caused in part by inappropriate RIA methods. Until now, there are no published results describing non-immunological identification of melatonin in the domestic pig. Therefore, the main-objective of this study was to establish a HPLC method for the determination of melatonin in plasma and saliva samples of domestic pigs and to examine the correlation of the melatonin concentration of these two specimens. A further aim of this study was the possible replacement of blood sampling which requires the restraint of the animal by minimally invasive saliva sampling. The study was conducted on 12 domestic crossbred pigs aged 14 weeks (6 gilts, 6 barrows), which were housed in single pens under standardized conditions and under an equatorial lightregime (LD 12:12). Photophase light intensities were set in two groups with 250 lux and 470 lux, scotophase light intensities were below 1,0 lux. Blood and saliva samples were collected over a period of 24 hours on two non-successive days with sampling intervalls of 3 hours. Following chloroform extraction, samples were analyzed by a HPLC system. Identification and quantification of melatonin were achieved by comparing the retention times with those of authentical standards containing a known melatonin concentration. Results of this study showed that the HPLC method is appropriate for the determination of melatonin concentrations of both plasma and saliva samples and comprises a remarkably high sensitivity, which allows a reliable measurement of melatonin concentrations even in photophase samples. Results revealed identical concentrations of both photophase and scotophase melatonin concentrations at a light intensity of 250 lux, indicating a lack of suppression of pineal melatonin secretion during photophase. This indicates that differences in hormone concentrations driven by day/night-changeovers were not sufficient for pigs to differenciate between day and night at a light intensity of 250 lux. Results also showed significantly lower photophase melatonin concentrations at a light intensity of 470 lux, compared to 250 lux. This indicates a stronger light-induced melatonin supression, not being able to synchronize melatonin secretion to the lightregimen completely and therefore may have been assessed as insufficient by the animals. Furthermore, results showed clear differences in the melatonin profiles of castrated male and intact female pigs. There was no correlation of salivary and plasma melatonin concentrations. Therefore blood samples cannot be replaced by minimal-invasive saliva samples. Further studies should be done to investigate the light intensity, which entrains the synchronisation of the melatonin profile to the lightregime. This could be done by using this highly sensitive HPLC method to assess the photic demands of domestic pigs kept in indoor piggeries. Particular attention should be given to the consequences of a potential effect of a stress-load on the animals and its stimulating effects on the synthesis of melatonin, as well as potential sex differences.

Abstract

Die Existenz einer Melatoninrhythmik des Hausschweines unter dem Einfluss der Lichtintensität wurde in der Literatur kontrovers diskutiert. Verantwortlich für die unterschiedlichen Ergebnisse dürften die teilweise ungeeigneten RIA-Methoden sein. Bislang existieren keine Untersuchungen, die eine nicht-immunologische Nachweismethode für Melatonin bei Schweinen beschreiben. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb die Etablierung einer HPLC-Methode zur Melatoninbestimmung aus Plasma- und Speichelproben des Hausschweines und die Überprüfung dieser Untersuchungsmedien hinsichtlich der Korrelation ihrer Melatoninkonzentrationen. Ein weiteres Ziel dieser Untersuchung war die bei Schweinen nur unter Anwendung von Zwangsmaßnahmen mögliche Blutprobenentnahme zur Melatoninbestimmung durch die minimal-invasive Speichelprobengewinnung ersetzen zu können. Die Untersuchungen wurden an zwölf Schweinen im Alter von 14 Wochen durchgeführt, die unter standardisierten Bedingungen bei einem äquatorialen Lichtregime (LD 12:12) einzeln gehalten wurden. Die Lichtintensitäten betrugen während der Tagphase 250 Lux bzw. 470 Lux, und während der Nachtphase maximal 1,0 Lux. Blut- und Speichelproben wurden an zwei nicht aufeinander folgenden Untersuchungstagen in dreistündigen Intervallen über je 24 Stunden entnommen. Die Proben wurden nach Chloroformextraktion über ein HPLC-System analysiert und ihre Melatoninkonzentrationen durch den Vergleich der Retentionszeiten mit jenen authentischer Standards mit einer bekannten Melatoninkonzentration bestimmt. Die HPLC-Methode ist sowohl zur Melatoninmessung in Plasma-, als auch in Speichelproben anwendbar und zeichnet sich durch ihre hohe Sensitivität (Messbereich: 56 pg/ml – 14 400 pg/ml) aus, die eine sichere Melatoninbestimmung auch aus Tagproben ermöglicht. Die Ergebnisse der Plasmamelatoninbestimmung zeigten bei einer Lichtintensität von 250 Lux identische Konzentrationen der Tag- und der Nachtproben, was auf eine fehlende Unterdrückung der pinealen Melatoninsekretion während der Tagphase hinweist. Ein Anstieg der Melatoninkonzentration während der Tagphase konnte auch durch eine Lichtintensität von 470 Lux nicht vollständig unterdrückt werden. Dies bedeutet, dass die durch den Tag/Nacht-Wechsel gesteuerten Unterschiede der Hormonkonzentration bei einer Lichtintensität von 250 Lux für die Schweine nicht ausreichten, um zwischen Tag und Nacht unterscheiden zu können. Die Ergebnisse zeigten signifikant niedrigere Melatoninkonzentrationen der Tagproben der bei 470 Lux gehaltenen Gruppe, was auf eine stärkere lichtinduzierte Suppression hindeutet, aber aufgrund einer unvollständigen Synchronisation mit dem Lichtregime ebenfalls als noch nicht ausreichend zu beurteilen ist. Die Ergebnisse wiesen darüber hinaus deutliche Unterschiede zwischen den Plasmamelatoninprofilen weiblicher und kastrierter männlicher Tiere auf. Für die Speichelmelatoninkonzentrationen konnte keine Korrelation mit den Plasmamelatoninkonzentrationen nachgewiesen werden. Aus diesem Grund können Blutproben zur Melatoninbestimmung nicht durch weniger belastende, minimal-invasive Speichelproben ersetzt werden. In zukünftigen Untersuchungen sollte deshalb unter Anwendung der HPLC-Methode festgestellt werden, bei welcher Lichtintensität Schweine ein mit dem Lichtregime synchronisiertes nokturnales Melatoninprofil ausbilden können, um unter Tierschutzaspekten den Tieren bei ganzjähriger Stallhaltung ausreichende Lichtverhältnisse bieten zu können. Hierbei sollten insbesondere die Auswirkungen eines potentiellen Einflusses der unter anderem mit einer frequenten Probengewinnung verbundenen Stressbelastung der Tiere auf die Stimulation der Melatoninsynthese, und potentielle Geschlechtsunterschiede (bzw. der Einfluss einer Kastration berücksichtigt werden.