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Vargas, Vivian (2004): Expression and function of GDNF family ligands and their receptors by human immune cells. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

GDNF (glial cell line-derived neurotrophic factor) und NTN (Neurturin), die zwei zuerst beschriebenen Liganden der GDNF-Familie, fungieren als Überlebens- und Entwicklungsfaktoren für definierte Populationen von zentralen und peripheren Neuronen. GDNF ist darüber hinaus für die Nierenentwicklung erforderlich. Für die Vermittlung ihrer biologischen Wirkung benutzten GDNF und NTN einen Rezeptor, der aus zwei Ketten besteht: Die Signal-transduzierende Komponente RET wird sowohl von GDNF als auch von NTN benutzt. RET wird von 21 Exonen kodiert und kommt in multiplen Spleiß-Varianten vor. Für die Liganden-Spezifität ist eine zweite Rezeptorkomponente verantwortlich, ein Mitglied der GFR-Familie. GFRa-1 bindet präferentiell GDNF, während GFRa-2 NTN stärker als GDNF bindet. Ziel dieser Arbeit war es, mögliche wechselseitige Interaktionen zwischen dem Nerven- und Immunsystem durch die GDNF-Familie zu untersuchen. Zu diesem Zweck wurde zunächst die Expression von GDNF, NTN und ihrer Rezeptoren in gereinigten Immunzell-Subtypen untersucht. Dabei zeigte sich, dass der Prototyp dieser Liganden-Familie, GDNF, von keiner der untersuchten Immunzellen exprimiert wurde. Hingegen wurde das verwandte NTN von T-Zellen, B-Zellen und Monozyten exprimiert wie mit RT-PCR, Western Blot und Immunzytochemie gesehen wurde. Transkripte für das zu NTN und GDNF verwandte Persephin (PSP) wurden in Monozyten und mononukleären Zellen des peripheren Blutes gefunden. Der Transmembran-Rezeptor RET wurde von allen untersuchten Immunzell-Subtypen exprimiert. B-Zellen und T-Zellen exprimierten unterschiedliche Isoformen von RET, sowohl im extrazellulären Liganden-bindenden als auch im intrazellulären Signal-transduzierenden Teil. Die Expression der Isoformen von RET wurde zudem in T-Zellen und B-Zellen noch stark durch Aktivierung reguliert. In CD8+ T-Zellen wurde auch eine bislang noch nicht beschriebene Spleiß-Variante am 5` Ende beobachtet. Im Gegensatz zu T-Zellen und B-Zellen exprimierten Monozyten nur die volle Länge von RET. Auch die Liganden-bindenden Ketten GFRa-1 und GFRa-2 wurden von Immunzellen exprimiert wie mit RT-PCR und FACS gesehen wurde. GFRa-2 war deutlich abundanter als GFRa-1. Von GFRa-2 wurden verschiedene Isoformen in Immunzellen gefunden. In der in T-Zellen und B-Zellen am stärksten exprimierten Isoform ist Exon 2 und 3 nicht enthalten. Dem resultierenden Protein fehlen die N-terminale Cystein-reiche Domäne und eine N-Glykosylierungsstelle, eine Region, die allerdings für die Bindung von NTN und die Interaktion mit RET entbehrlich ist. Mögliche Effekte von GDNF und NTN auf Immunzellen wurden untersucht. Dabei zeigte sich, dass GDNF und NTN an der Regulation von TNF-alpha beteiligt sind. Wenn GDNF oder NTN nach 5 oder 6 Tagen zu LPS+IFN-g stimulierten Blutzellen oder zu ConA aktivierten T-Zellen gegeben wurde, dann war nach weiteren 24 h der TNF-a-Gehalt im Überstand reduziert. Weitere Experimente wiesen daraufhin, dass diese Reduktion des TNF-a-Gehalts auf eine verstärkte Aufnahme oder Verbrauch zurückzuführen ist. Proliferation, Expression von Aktivierungsmarkern (HLA-DR, CD38, CD40, CD69, CD86) oder Produktion von IFN-g und IL-4 wurden durch GDNF und NTN nicht beeinflusst. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass Immunzellen den neurotrophen Faktor NTN produzieren und Rezeptoren für GDNF und NTN besitzen. Multiple Isoformen der Signal-transduzierenden Kette RET wurden exprimiert und durch Aktivierung reguliert. NTN und GDNF regulierten in aktivierten T-Zellen und Monozyten die Aufnahme oder den Verbrauch von TNF-a. Diese Befunde weisen daraufhin, dass Immunzellen miteinander und auch mit dem Nervensystem mit Hilfe der GDNF-Familie interagieren können.

Abstract

GDNF (Glial cell line-Derived Neurotrophic Factor) and NTN (Neurturin) are two of the four members of the GDNF family ligands (GFLs) and are potent survival and developmental factors for the kidney as well as the peripheral and central neurons. Persephin (PSP), a third family member, behaves only as survival factor for central neurons. GDNF and NTN signaling is mediated by a two-component receptor containing a ligand specific binding component, GFRa-1 (higher GDNF affinity) and GFRa-2 (higher NTN affinity) respectively, and the common signal transducing component, RET. PSP signals only through the binding to GFRa-4 and RET. The aim of this study was to investigate possible mutual interactions between the nervous and immune system mediated by GFLs and their receptors. While GDNF, the prototype of its family, was not expressed by any of the studied human immune cells, the related molecule NTN, was found to be expressed by T and B cells and monocytes as seen by RT-PCR, Western blot and immunocytochemistry. Additionally, PSP was found in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) by RT-PCR. The RET gene, expressed in all the studied immune cells, contains 21 exons and encodes a tyrosine kinase receptor. Multiple splice variants of this gene have been described. Various cell subsets were found to express distinct RET 3’ or 5’-isoforms. In T and B cells, the expression of the 3’-end RET isoforms, where CD4+ and CD8+-T lymphocytes show different expressions patterns, was regulated by cell activation. At the 5’-end however, a new isoform that lacks exon 5, resulted in a partial deletion of the receptor’s extracellular part. The latter was detected only in CD8+-T cells (non-activated and activated cells) and in non-activated B cells. Interestingly, monocytes expressed full length RET mRNA indicating their responsiveness to GFLs. Immune cells also expressed the GDNF and NTN binding components: named GFRa-1 and GFRa-2. Whereas the GFRa-1 receptor was mostly detected on monocytes, GFRa-2 was abundantly expressed on both, monocytes and lymphocytes. Several GFRa-2 isoforms were detected in various cell types, the most abundant, which lack exons 2 and 3, was observed in T cells and monocytes. The predicted protein therefore loses its N-terminal cysteine-rich domain and one of the N-glycosylation sites, a region not critical for the binding of NTN and interaction with RET. Several experiments were performed to find out the functional effects NTN or GDNF might have on immune cells. The expression of the activation markers, HLA-DR, CD38, CD40, CD69, and CD86 was not modulated neither was the proliferation nor production of IL-4 and IFN-g. However, TNF-alpha was found to be regulated by both NTN and GDNF: when GDNF or NTN was added to PBMCs five or six days after activation by LPS+IFN-g or by ConA, a reduced amount of TNF-a was observed after 24 hours. Data from diverse experiments suggested that the decrease in TNF-a was due to an increased uptake or consumption rather than a reduced production. In summary, this study shows that all subsets of human immune cells express the ligand NTN, up-regulated after cell activation, and probably PSP mRNA, as well as the receptor GFRa-1 and predominantly GFRa-2 with protein upregulation seen upon cellular activation; that multiple isoforms of the signaling component RET were constitutively expressed and then regulated by cellular activation. Whether the transmembrane receptor levels differ upon activation remains unclear and as well as NTN and GDNF modulating the uptake and/or consumption of TNF-a. These findings suggest that immune cells communicate with each other and with the nervous system via GFLs.