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Munck, Sebastian (2004): Von der Form zur Richtung: Eine Untersuchung über den Einfluss der Form eines cytoplasmatischen cAMP Gradienten auf das Richtungswachstum von Wachstumskegeln sensorischer Nerven von Gallus gallus. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Growth cones, the terminal structures of elongating neurites are important for development and regeneration. The second messenger cAMP regulates both processes. cAMP is also known to induce growth cone turning. By using time-lapse microscopy and release of cAMP from biological inactive caged compounds the directional response of neuronal growth cones was investigated. Intracellular gradients were induced by asymmetric release of cAMP on one side of the growth cone. Using a new method, which released the same amount cAMP independent of the stimulation pattern it was possible to show that pulsed release in contrast to continuous release was more effective in inducing growth cone turning. From experiments with several pharmacological agents it can be concluded that the protein kinase A plays a major role for the cellular responses and that the gradient steepness causes the different reactions. In cooperation with other scientists it was ruled out that the different responses were caused by non-linearities of the caged compound. Furthermore cAMP gradients were visualized directly in HeLa cells expressing cAMP sensitive ion channels as a reporter system. With this cell line it was also possible to show that the stimulation pattern, meaning pulsed and continuous release respectively, influences the gradient shape. This finding was in accordance with published theories and numerical calculations. Here it was shown for the first time that the spatio-temporal properties of the intracellular gradient are crucial for growth cone turning.

Abstract

Sowohl bei der Entwicklung als auch der Regeneration des Nervensystems spielen die wachsenden Enden von Nerven, sogenannte neuronale Wachstumskegel, eine wichtige Rolle. Es ist bekannt, dass beide Prozesse durch den Zweitbotenstoff cAMP reguliert werden und dass dieser das Richtungswachstum beeinflussen kann. In der vorliegenden Arbeit wurde mit Hilfe von Zeitraffer-Mikroskopie und der Freisetzung von cAMP aus biologisch inaktiven Käfigsubstanzen das Richtungswachstum von neuronalen Wachstumskegeln untersucht. Durch asymmetrische Freisetzung des cAMP auf einer Seite des Wachstumskegels wurden intrazelluläre cAMP Gradienten erzeugt. Mit einer neu entwickelten Methode, bei der mit verschiedenen Freisetzungsmustern immer die gleiche Menge cAMP freigesetzt wurde, konnte gezeigt werden, dass eine gepulste Freisetzung im Gegensatz zur kontinuierlichen das Richtungswachstum beeinflusst. Experimente mit verschiedenen Pharmaka legen den Schluss nahe, dass die Protein Kinase A für die Antworten der Zellen und die Gradientensteilheit für die unterschiedliche Wirksamkeit von gepulster und kontinuierlicher Erzeugung des cAMP verantwortlich sind. In Zusammenarbeit mit anderen Wissenschaftlern konnte des Weiteren ausgeschlossen werden, dass die unterschiedlichen Ergebnisse bei kontinuierlicher und gepulster Freisetzung durch einen Artefakt oder nichtlineare Effekte bei der Freisetzung der Käfigsubstanz zustandekamen. Zudem konnte mit Hilfe einer Zellinie, die cAMP sensitive Kanälen stabil exprimiert, gezeigt werden, dass es möglich ist, intrazelluläre cAMP Gradienten zu erzeugen und dass unterschiedliche Freisetzungsmuster, das heißt kontinuierliche und gepulste Freisetzung, zu unterschiedlichen Gradienten führen. Dieser Befund konnte des Weiteren mit Hilfe einer numerischen Simulation mit den gängigen Theorien abgeglichen werden. In der vorliegenden Arbeit wurde erstmals gezeigt, dass die raum-zeitliche Form von intrazellulären Gradienten für die Orientierung von neuronalen Fortsätzen ausschlaggebend ist.