Logo
DeutschClear Cookie - decide language by browser settings
Kufer, Thomas (2004): Regulation der humanen Aurora-A Kinase und Identifikation potentieller Interaktionspartner. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
[img]
Preview
PDF
Kufer_Thomas.pdf

5Mb

Abstract

The error-free segregation of duplicated chromosomes during cell division is essential for the maintenance of an intact genome. This process is brought about by a highly dynamic bipolar array of microtubules, the mitotic spindle. Prominent amongst the regulators of the mitotic spindle is the serine/threonine-specific protein kinase Aurora-A. However, only a few interaction partners and physiological substrates of Aurora-A are know to date and the function of this important kinase is only beginning to emerge. To gain further insight in the cellular function of Aurora-A I set out studies to characterize Aurora-A and to identify new interaction partners of Aurora-A. To characterize the cellular function of Aurora-A the siRNA phenotype of Aurora-A was analysed. This showed that Aurora-A depletion in human HeLa cells led to apoptosis and spindle defects. To identify new Aurora-A interacting proteins a polyclonal antibody against Aurora-A was generated and used in co-immunoprecipitations from cell extracts. In addition Yeast-Two-Hybrid Screening and fishing experiments with recombinant proteins were performed. These studies provided four new putative Aurora-A interacting partners (KIAA1007, KIAA1741, TPX2 and a candidate from the Yeast-Two-Hybrid Screen). The interaction of these proteins with Aurora-A was verified using different biochemical methods. KIAA1741 and TPX2 were analysed in more detail. A polyclonal antibody against KIAA1741 was generated and KIAA1741 was shown to localize to actin rich structures within the cell. KIAA1741 interacted with recombinant Aurora-A showing a higher affinity for the catalytically active kinase in mitosis. Depletion of KIAA1741 by siRNA induced a G1 arrest. Interestingly KIAA1741 was a good in vitro substrate of Aurora-A. Most importantly this study revealed that Aurora-A binds to TPX2, a known component of the spindle apparatus. Binding studies demonstrated that the first 43 amino acids of TPX2 were sufficient and necessary for the interaction with the C-terminal catalytic domain of Aurora A. Although kinase activity was not required for this interaction, TPX2 was readily phosphorylated by Aurora-A on serine residues. Upon siRNA-mediated elimination of TPX2 from cells, the association of Aurora-A with the spindle microtubules was abolished. Furthermore these experiments showed that TPX2 was essential for the formation of a bipolar spindle and spindle pole integrity. Moreover I could demonstrate that TPX2 activates the Aurora-A kinase activity in a microtubule dependant manner, indicating that TPX2 is a new regulator of Aurora-A.

Abstract

Während der Zellteilung ist die exakte Segregation des genetischen Materials auf die beiden neu entstehenden Tochterzellen essentiell für das Überleben der Zellen. Dies wird in höheren Eukaryoten durch eine dynamische Anordnung von Mikrotubuli, die mitotische Spindel, vermittelt. In der Regulation des Ablaufes der Mitose und der mitotischen Spindel, spielt reversible Proteinphosphorylierung durch mitotische Proteinkinasen und Phosphatasen eine entscheidende Rolle. Ein wichtiger Regulator der mitotischen Spindel ist die Serin-Threonin Proteinkinase Aurora-A. Kinasen der Aurora-A Familie zeigen ein komplexes Regulations- und Lokalisationsmuster in der Zelle, was auf vielfältige Funktionen in der Zelle schließen lässt. Wie Aurora-A auf molekularer Ebene reguliert wird und wie die Kinase ihre Funktionen in der Zelle ausübt, ist jedoch noch nicht im Detail verstanden. So ist auch die Anzahl der identifizierten Aurora-A Substrate und Interaktionspartner gering. Um die Funktion der humanen Aurora-A Kinase besser verstehen zu können, ist es notwendig, weitere Bindungspartner und in vivo Substrate zu identifizieren sowie Aurora-A auf molekularer Ebene näher zu charakterisieren. Um Aurora-A zu charakterisieren, wurde rekombinante Aurora-A Kinase exprimiert. Es konnte gezeigt werden, dass die rekombinante Kinase in vitro aktiv war und Serin- und Threoninreste in der katalytischen Domäne autophosphoryliert wurden. Durch die Herstellung eines spezifischen polyklonalen Antiserums gegen Aurora-A wurde das endogene Protein in humanen Zelllinien charakterisiert. Immunfluoreszenz-Analysen zeigten, dass Aurora-A in der G2/M-Phase, nicht jedoch in der G1- und S-Phase exprimiert wurde. Die Kinase lokalisierte in der G2-Phase an die Centrosomen, wohingegen in der Mitose Aurora-A neben den Spindelpolen auch an den Spindel-Mikrotubuli nachgewiesen wurde. Durch siRNA wurde der Phänotyp der Depletion von Aurora-A in humanen HeLa S3 Zellen analysiert. Depletion von Aurora-A durch siRNA führte in erster Linie zu einer erhöhten Apoptose. Aurora-A Depletion interferierte nicht mit der Ausbildung einer bipolaren Spindel, es wurden jedoch breitere Spindelpole und leichte Mikrotubuli-Organisationsstörungen beobachtet. In der vorliegenden Arbeit wurden ferner Substrate und Interaktionspartner der humanen Aurora-A Kinase identifiziert, validiert und näher auf molekularer Ebene charakterisiert. Mittels Yeast-Two-Hybrid (Y2H) Screening, in vitro Bindungsexperimenten und Co-Immunpräzipitationen konnten vier neue potentielle Bindungspartner von Aurora-A (KIAA1007, KIAA1741, TPX2 und ein Kandidat aus dem Y2H Screen) isoliert werden. Zwei dieser Bindungspartner waren zudem in vitro Substrate der Kinase. Die Interaktionspartner KIAA1741 und TPX2 wurden biochemisch und zellbiologisch eingehender charakterisiert. Gegen das hochmolekulare Protein KIAA1747 (182 kDa) wurde ein spezifisches polyklonales Antiserum erzeugt und die Lokalisation und Interaktion mit Aurora-A wurde analysiert. KIAA1741 zeigte eine Co-Lokalisation mit aktinreichen Strukturen und dem Zellkortex. Diese Lokalisation konnte durch Expression eines myc KIAA1741-Fusionsproteins bestätigt werden. KIAA1741 war zellzyklusunabhängig exprimiert und zeigte eine Retardation der elektrophoretischen Mobilität in der M-Phase. Co Immunpräzipitations Experimente bestätigten, dass KIAA1741 in der M-Phase mit endogener Aurora A Kinase interagierte. Bindungsexperimente mit rekombinanter Aurora A Kinase und Zellextrakten aus humanen HeLa S3 Zellen bestätigten diese Interaktion und zeigten zudem, dass KIAA1741 in der Mitose eine geringere Affinität für eine katalytisch inaktive Mutante (K162R) der Kinase zeigte. KIAA1714 wurde ferner von Aurora-A in vitro phosphoryliert und stellte das beste derzeit isolierte hochmolekulare Substrat von Aurora-A dar. Depletion von KIAA1741 über siRNA führte zu einem G1-Arrest in HeLa S3 Zellen. Als interessantester neuer Aurora-A Bindungspartner wurde TPX2 identifiziert. TPX2 ist ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein, welches über RanGTP und Importin alpha/beta Bindung reguliert wird. TPX2 ist im Krallenfrosch Xenopus laevis essentiell für die Ausbildung der mitotischen Spindel. Durch Bindungsexperimente mit rekombinanten und in vitro translatierten Proteinen, konnte hier gezeigt werden, dass die katalytische Domäne von Aurora-A direkt mit dem Aminoterminus (AS 1-43) von TPX2 interagierte. Diese Bindung war unabhängig von der Aurora-A Kinaseaktivität. TPX2 war zudem ein Substrat und wurde in vitro von Aurora A an Serinresten im Aminoterminus phosphoryliert. TPX2 und Aurora-A co lokalisierten an den Spindel-Mikrotubuli in vivo. Durch siRNA von TPX2 beziehungsweise Aurora-A in humanen HeLa Zellen konnte gezeigt werden, dass die Lokalisation von Aurora-A an den Spindel-Mikrotubuli abhängig von TPX2 war, wohingegen TPX2 unabhängig von Aurora-A lokalisierte. Die Depletion von TPX2 in HeLa S3 Zellen führte zu einem Metaphase-Arrest mit starken Spindeldefekten sowie zur Fragmentierung der Spindelpole. Phosphorylierungs-Studien demonstrierten zudem, dass TPX2 in vitro als Aktivator der Aurora-A Kinaseaktivität fungierte. Mikrotubuli vermochten hierbei die Aktivierung der Kinaseaktivität von Aurora-A durch TPX2 weiter signifikant zu steigern. Kinaseassays mit Fragmenten des humanen TPX2 Proteins zeigten, dass die aminoterminale Domäne von TPX2 (AS 1-43) notwendig und ausreichend für diese Aktivierung von Aurora-A war. Mit TPX2 konnte somit erstmals ein wichtiger Regulator der humanen Aurora-A Kinase identifiziert und auf molekularer Ebene charakterisiert werden. Das TPX2 Protein ist notwendig für die Lokalisation und Aktivierung der humanen Aurora-A Kinase an die Spindel-Mikrotubuli und essentiell für die Bildung einer biploaren mitotischen Spindel in humanen Zellen.