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Mühlhoff, Marei (2004): Beteiligung der Phospholipase D an der Regulation der Synthese von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat durch Arf- und Rho-GTPasen. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

The reaction product of phospholipase D (PLD), phosphatidic acid (PA), was found to stimulate phosphatidylinositol-4-phosphate-5-kinase (PIP-5-kinase) activity in vitro. In the present study, we have examined wether PLD affects the synthesis of phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate (PIP2) by PIP-5-kinase. Overexpression of PLD isoforms in HEK-293 cells led to an increase in PIP-5-kinase activity and to elevated PIP2 levels in intact cells. As both PLD and PIP-5-kinase are stimulated by the GTPases Arf1 and RhoA, we investigated in the following, if PLD is involved in the regulation of PIP2 synthesis by these GTPases. Both PLD1- and PLD2-induced PIP2 synthesis was completely blocked by coexpression of catalytically inactive Arf1 T31N. Reversely, the effect of constitutive active Arf1 Q71L was fully inhibited by catalytically inactive PLD constructs. Whereas the effects of Arf1 Q71L and wild-type PLD2 were additive, coexpression of Arf1 Q71L with wild-type PLD1 led to a synergistic increase in PIP-5-kinase activity. Previously, we have shown that RhoA regulates the activity of PLD and PIP-5-kinase by its downstream effector Rho-kinase. Expression of small amounts of inactive PLD1, but not of PLD2, nearly completely abolished Rho-kinase-stimulated PIP-5-kinase activity. Also expression of a non-phosphorylatable mutant of cofilin, which participates in the signalling cascade from RhoA via Rho-kinase and LIM-kinase to PLD1, suppressed the stimulating effect of Rho-kinase on PIP2 synthesis. These findings suggest that PLD1 is involved in the stimulation of PIP-5-kinase by Arf1 as well as by RhoA and Rho-kinase. After sucrose density gradient centrifugation of HEK-293 cell lysates, we isolated two separate PIP2 pools. PLD1 and Arf1 selectively control the non-caveolar PIP2 pool in the high density fraction, whereas PLD2 affected PIP2 in both pools. In summary, these data suggest that particularly PLD1, apparently by the production of PA, functions as a physiological regulator of PIP-5-kinase that controls the synthesis of cellular PIP2 downstream to Arf1 and RhoA.

Abstract

Phosphatidsäure (PA), das Reaktionsprodukt der Phospholipase D (PLD), kann in vitro die Aktivität der Phosphatidylinositol-4-phosphat-5-kinase (PIP-5-kinase) stimulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob die PLD die Synthese von Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) durch die PIP-5-kinase beeinflusst. Überexpression von PLD-Isoformen in HEK-293-Zellen führte zu einer Steigerung der PIP-5-kinase-Aktivität und zu einem Anstieg des PIP2-Gehaltes in intakten Zellen. Da die GTPasen Arf1 und RhoA sowohl die PLD als auch die PIP-5-kinase stimulieren, wurde im Folgenden untersucht, ob die PLD an der Regulation der PIP2-Synthese durch diese GTPasen beteiligt ist. Die durch die beiden PLD-Isoformen PLD1 und PLD2 gesteigerte PIP2-Synthese konnte durch Koexpression der inaktiven Arf1-Mutante Arf1 T31N vollständig verhindert werden. Umgekehrt wurde der Effekt der konstitutiv aktiven Arf1-Mutante Arf1 Q71L durch Koexpression von katalytisch inaktiven PLD-Konstrukten komplett gehemmt. Während die Effekte von Arf1 Q71L und Wild-Typ PLD2 additiv waren, führte die Koexpression von Arf1 Q71L mit Wild-Typ PLD1 zu einer synergistischen Steigerung der PIP-5-kinase-Aktivität. RhoA reguliert über seinen nachgeschalteten Effektor Rho-kinase die Aktivität der PLD und der PIP-5-kinase. Expression von geringen Mengen der inaktiven PLD1, aber nicht der PLD2, führte zu einer nahezu kompletten Hemmung der durch Rho-kinase stimulierten PIP-5-kinase-Aktivität. Auch die Expression einer nichtphosphorylierbaren Mutante von Cofilin, das in die Signalkaskade von RhoA über Rho-kinase und LIM-kinase zur PLD1 eingeschaltet ist, unterdrückte den stimulierenden Effekt der Rho-kinase auf die PIP2-Synthese. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die PLD1 sowohl bei der Stimulation der PIP-5-kinase durch Arf1 als auch durch RhoA und Rho-kinase beteiligt ist. Mittels Sucrosedichtegradientenzentrifugation von Lysaten von HEK-293-Zellen konnten zwei separate PIP2-Pools isoliert werden. PLD1 und Arf1 kontrollierten selektiv den nicht-caveolären PIP2-Pool im high density Bereich, während die PLD2 den PIP2-Gehalt in beiden Pools beeinflusste. Zusammengefasst deuten diese Daten darauf hin, dass insbesondere die Isoform PLD1, vermutlich über die Bildung von PA, einen physiologischen Regulator der PIP-5-kinase darstellt und nachgeschaltet zu Arf1 und RhoA die Synthese von PIP2 kontrolliert.