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Umlauf, Christian (2004): Herstellung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper gegen equine Leukozyten. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Production and characterization of monoclonal antibodies specific for equine leucocytes This work was initiated to produce new monoclonal antibodies for the characterization of equine leucocyte-subpopulations. For immunisation, leucocytes isolated from the peripherial blood, lymph nodes and the intestinal epithelium of horses, have been used. Out of six cell-fusions 78 clons were isolated. To characterize the mAbs, the attention was focused on immunofluorescence analysis. Antibodies of the clones 4-13, 4-58, 1-19 and 6-39 have been purified by protein G-sepharoses chromatography and, except mAb 4-58, biotinylated. MAb 4-13, mAb 4-58 and mAb 5-50 are binding specifically to equine T-cells. Flow cytometer analyses demonstrated an increased frequency following the stimulation with Concanavalin A. The frequency of mAb 4-13- and mAb 4-58-positive cells matched the total frequency of CD4- and CD8-positive cells. The number of cells, marked by mAb 5-50, is slightly lower. Most likely these three mAbs recognize three different, as yet unknown antigens. MAb 4-58 stimulated the in vitro proliferation of leucocytes. Moreover mRNA for interleukin-4 and interferon gamma was detected in these cells after the stimulation. By contrast the antibodies 1-19, 2-52, 4-36, 4-55 and 6-39 are B-cell-specific, since they were present on cells that were Ig-positive. The monoclonal antibodies 6-5 and 6-17 stain all equine leucocytes. Possibly they are binding to an equine CD45-molecule. The antibodies of clone 4-18 recognize an antigen on granulocyctes. Preliminary data suggests that mab 4-39 is binding to a lektin, that can be found mainly on B-Lymphocytes and endothelial cells. No group of leucocytes and no antigen could be assigned to the other antibodies. The antibodies described here will be valuable tools to characterize different equine leucocyte-subpopulations by flow cytometry.

Abstract

Ziel dieser Arbeit war es, neue Antikörper zur Charakterisierung von Leukozytenpopulationen des Pferdes herzustellen. Zur Immunisierung wurden Leukozyten aus der peripheren Blutbahn, aus Lymphknoten und aus dem intestinalen Epithel von Pferden verwendet. Aus sechs Zellfusionen konnten 78 Klone gewonnen werden. Die wichtigste Methode zur Charakterisierung der mAk war die Immunfluoreszenzanalyse. Die monoklonalen Antikörper der Klone 4-13, 4-58, 1-19 und 6-39 wurden mit Hilfe einer G-Sepharose-Säule gereinigt und, mit Ausnahme von mAk 4-58, biotinyliert. MAk 4-13, mAk 4-58 und mAk 5-50 binden spezifisch an equine T-Zellen. In durchflusszytometrischen Analysen steigt die Frequenz der positiven Zellen nach Stimulation mit Concanavalin A an. MAk 4-13 und mAk 4-58 binden an so viele Lymphozyten, wie CD4-positive und CD8-positive Zellen zusammen in der Präparation vorkommen. Die Anzahl der durch mAk 5-50 markierten Zellen liegt knapp darunter. Mit hoher Wahrscheinlichkeit erkennen sie drei verschiedene, bisher nicht beschriebene Antigene. MAk 4-58 regt in vitro Leukozyten zur Proliferation an, in denen nach der Stimulation mRNA von Interleukin-4 und Interferon gamma nachgewiesen werden konnte. Dagegen können die Antikörper der Klone 1-19, 2-52, 4-36, 4-55 und 6-39 als B-Zell-spezifisch bezeichnet werden, wie die Zwei-Farben-Immunfluoreszenzanalyse mit dem Kontrollantikörper Anti-Ig-Pferd-FITC belegt. MAk 6-5 und 6-17 markieren alle equinen Leukozyten. Möglicherweise binden sie an ein equines CD45-Molekül. Die Antikörper des Klons 4-18 erkennen ein Antigen auf Granulozyten. Einige Daten weisen darauf hin, dass mAk 4-39 an ein Lektin bindet, welches überwiegend auf B-Zellen und auf Endothelzellen vorkommt. Den übrigen Antikörpern konnte keine Gruppe von Leukozyten und kein Antigen zugeordnet werden. Mit Hilfe der hier beschriebenen monoklonalen Antikörper lassen sich zukünftig verschiedene Lymphozytenpopulationen des Pferdes in der Durchflusszytometrie klar unterscheiden.