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Vogl, Sigrid (2004): Molekular-phylogenetische Differenzierung von Babesien des Rindes. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Molecular phylogenetic differentiation of bovine Babesia In the present study, Babesia bovis, B. bigemina, B. divergens and B. ovata were differentiated with molecular biological techniques. These are four babesia species of cattle which are important in veterinary medicine. In addition to that, relationships within species were investigated. Therefore, two ribosomal DNA (rDNA) genes from babesia of different geographical origin were amplified and sequenced and then analyzed with regard of their phylogenetic correlation. Altogether 50 blood samples were examined, deriving from naturally infected animals or vaccine strains. 11 isolates originated from Europe, 22 from North- und South America, 5 from Africa, 4 from Asia and 8 from Australia. Previously, the Babesia contained in the samples had been assigned to the different species, using phenotypic characteristics. For the PCR amplifications of the 18S gene using the primers RIB-19 and RIB-20 and of the ITS region with the primers RIB-3 and RIB-13 PCR protocols developed for babesia of dogs were used. These were directly applied for B. divergens and, after optimization of MgCl2, DMSO, BSA concentrations and cycle number, with modifications also for B. bovis, B. bigemina and B. ovata. The length of the directly sequenced PCR products of the 18S rDNA was 1448 to 1552 base pairs for B. bovis, 1481 to 1485 bp for B. bigemina and 1516 to 1519 bp for B. divergens, exept one isolate which originated from a human infection and had a length of 1535 bp. For B. ovata, only a partial sequence of 889 bp was obtained. Compared with corresponding genebank sequences, the declared babesia species was confirmed with exception of one isolate. The PCR products of the ITS region were sequenced after cloning and their length resulted in 654 to 729 bp for B. bovis, 883 bp for B. ovata, 923 to 943 bp for B. bigemina and 995 to 997 bp for B. divergens. Despite the variability of the ITS sequence length of the B. bovis und B. bigemina isolates, this feature indicates characteristic values for each species. In the present study the ITS region of bovine Babesia was sequenced and analysed for the first time. With the phylogenetic analysis of the 18S sequences the four examined babesia species of the cattle could unequivocally be distinguished. Different phylogenetic trees (dendrograms) generated with the algorithms Distance Matrix, Maximum Parsimony and Maximum Likelihood showed all isolates in separated species groups. High bootstrap values (Distance Matrix and Maximum Parsimony) of 100 % for B. divergens, for B. bovis and B. bigemina, and 94 % resp. 70 % for B. ovata support the classification in four species. An additional phylogenetic analysis including also piroplasms of other hosts demonstrated a separation of bovine babesia species without overlap. Thereby, the present taxonomy and validity of the species B. divergens, B. bovis, B. bigemina and probably B. ovata were confirmed for the isolates examined in this study. It was not possible to differentiate between the B. divergens isolate collected from a human and the other B. divergens isolates which were very homogeneous. An additional intraspecific analysis for B. bovis and B. bigemina represented the heterogeneity of these two species in different dendrograms. The analysis of the ITS region was based on 95 clones, produced from 50 Babesia bovis, B. bigemina, B. divergens and B. ovata isolates of different geographic origin. Within the B. bovis and B. bigemina isolates an enormous variability was detected. This finding was indicated by intraisolate identities from 93,7 to 100 % for B. bovis and 95,8 to 100 % for B. bigemina. In contrast, the intraisolate identities of B. divergens clones (99,4 to 100 %) and the two B. ovata sequences (100 %) reached high values. On a species level, all clones within each species were compared. This procedure indicated the variability between isolates within each species. Thereby, the homogeneity of the B. divergens clones was confirmed by the identity of at least 99,1 % between two sequences. The corresponding values of B. bigemina (92,7 %) and B. bovis (82,7 %) turned out to be lower. The heterogeneity within the two species was confirmed by these identity scores and by the fact that clones from different isolates exhibited higher identities than clones from the same isolate. In the phylogenetic analysis of ITS sequences dendrograms for each species were generated with the algorithms Distance Matrix, Maximum Parsimony und Maximum Likelihood. The heterogeneity within B. bovis and B. bigemina was reflected by the fact that separated groups of isolates occurred in the phylogenetic trees. In addition, these groups correlated with their geographical origin. The phylogenetic relationship between isolates from Southern Africa and Australia was remarkably high. B. bigemina isolates were separated into two groups: one included the isolates from Australia und South Africa, the other isolates from Latin America. Within B. bovis four isolate groups of different geographic origin were detected. The first included isolates from Israel, Turkey and Morocco, the second isolates from Australia and South Africa. The Brazilian isolates appeared in the third group and the remaining isolates from the Americas in the fourth. There was no arrangement of isolates in phylogenetic trees of B. divergens.

Abstract

Molekular-phylogenetische Differenzierung von Babesien des Rindes In der vorliegenden Arbeit wurden Babesia bovis, B. bigemina, B. divergens und B. ovata, vier veterinärmedizinisch bedeutende Babesienarten des Rindes, mit molekularbiologischen Methoden differenziert und Verwandtschaftsbeziehungen innerhalb der Arten untersucht. Dazu wurden bei Babesien unterschiedlicher geographischer Herkunft zwei Genabschnitte der ribosomalen DNA (rDNA) mittels PCR amplifiziert und, nach anschließender Sequenzierung, phylogenetischen Analysen unterzogen. Insgesamt wurden 50 Blutproben von Tieren mit natürlicher Infektion oder von Impfstämmen untersucht. Davon stammten 11 Isolate aus Europa, 22 aus Nord- und Südamerika, 5 aus Afrika, 4 aus Asien und 8 aus Australien. Die in den Proben enthaltenen Babesien waren zuvor anhand phänotypischer Merkmale einzelnen Arten zugeordnet worden. Die Amplifizierung der 18S-rDNA mit den Primern RIB-19 und RIB-20 und der ITS-Region mit den Primern RIB-3 und RIB-13 erfolgte nach bereits bei Hundebabesien eingesetzten PCR-Protokollen. Diese wurden für B. divergens unverändert und, nach Optimierung von MgCl2-, DMSO-, BSA-Konzentration und Zyklenzahl, modifiziert für die Arten B. bovis, B. bigemina und B. ovata, verwendet. Die Sequenzlängen der direkt sequenzierten PCRProdukte der 18S-rDNA betrugen bei B. bovis 1448-1552, bei B. bigemina 1481-1485, bei B. divergens 1516-1519 Basen, mit Ausnahme des einzigen vom Menschen stammenden Isolates mit 1535 Basen. Für B. ovata wurde eine Teilsequenz von 889 Basen erhalten. Vergleiche mit 18S-Sequenzen aus der Genbank bestätigten bis auf eine Ausnahme, die bei Einsendung der Proben angegebene Babesienart. Die Amplifikate der ITS-Region, die erst nach Klonierung sequenziert wurden, ergaben Sequenzlängen von 654-729 Basen für B. bovis, 883 Basen für B. ovata, 923-943 Basen für B. bigemina und 995-997 Basen für B. divergens. Qbwohl die ITS-Sequenzlängen bei den Isolaten von B. bovis und B. bigemina sehr variabel waren, grenzten sich die einzelnen Arten anhand der Größe dieser Amplifikate voneinander ab. Dieser Genabschnitt wurde für Rinderbabesien in der vorliegenden Arbeit erstmals sequenziert und analysiert. Die phylogenetische Analyse der 18S-Sequenzen ermöglichte eine Differenzierung der vier untersuchten Babesienarten des Rindes. In verschiedenen Dendrogrammen, die mit drei unterschiedlichen Methoden (Distanz-Matrix, Maximum-Parsimony und Maximum- Likelihood) erzeugt wurden, war eine nach den einzelnen Arten getrennte Aufzweigung aller Isolate ersichtlich. Hohe Bootstrap-Werte (Distanz-Matrix und Maximum-Parsimony) von je 100 % für die Arten B. divergens, B. bovis und B. bigemina, und 94 bzw. 70 % für B. ovata unterstützten dabei die Einteilung in vier getrennte Arten. Zudem grenzten sich in einer weiteren Analyse die Rinderbabesienarten auch von Piroplasmen anderer Wirtstiere überlappungsfrei ab. Damit wurde, bei den hier untersuchten Isolaten, die derzeit bestehende Taxonomie und Validität der Arten B. divergens, B. bovis, B. bigemina und wahrscheinlich auch B. ovata bestätigt. Das vom Menschen stammende B. divergens-Isolat war in der phylogenetischen Analyse nicht von den anderen B. divergens Isolaten, die alle sehr homogen waren, zu differenzieren. Aus den Dendrogrammen der, für B. bovis und B. bigemina zusätzlich durchgeführten, intraspezifischen Analyse der 18S-rDNA, ging deutlich die Heterogenität der beiden Arten hervor. Die Analyse der ITS-Region basierte auf 95 Klonen der insgesamt 50 geographisch unterschiedlichen Isolate der Arten Babesia bovis, B. bigemina, B. divergens und B. ovata. Eine große genetische Variabilität innerhalb von Isolaten wurde bei B. bovis und B. bigemina festgestellt. Dies wurde durch Intraisolat-Identitäten von 93,7-100 % für B. bovis und 95,8- 100 % für B. bigemina angezeigt. Die Intraisolat-Identitäten der Klone von B. divergens (99,4-100 %) und der beiden B. ovata-Sequenzen (100 %) dagegen waren sehr hoch. Bei Betrachtung der Variabilität zwischen Isolaten einer Art bestätigte der Sequenzvergleich aller Klone einer Art die Homogenität von B. divergens auch auf Artebene. Die geringste Identität zweier Sequenzen betrug 99,1 %. Bei B. bigemina und B. bovis lagen die entsprechenden Werte mit 92,7 % bzw. 82,7 % wesentlich niedriger. Die geringen Identitäten und die Tatsache, dass Klone unterschiedlicher Isolate höhere Identitäten besaßen, als die desselben Isolates, belegte die Heterogenität innerhalb der beiden Arten. In der phylogenetischen Analyse der ITS-Sequenzen, bei der für jede Babesienart verschiedene Dendrogramme nach Distanz-Matrix, Maximum-Parsimony und Maximum- Likelihood-Methoden erstellt wurden, spiegelten sich die Heterogenitäten von B. bovis und B. bigemina in abgegrenzten Isolatgruppen wieder. Zudem wurde eine Korrelation dieser Gruppen mit ihrer geographischen Herkunft nachgewiesen. Vor allem die Isolate aus dem südlichen Afrika und Australien besaßen eine hohe phylogenetische Verwandtschaft. Bei B. bigemina ließen sich zwei große Isolatgruppen unterscheiden, von denen eine die Isolate aus Australien und Südafrika, die andere Isolate aus Lateinamerika enthielt. Die B. bovis-Isolate verteilten sich auf vier geographisch unterschiedliche Gruppen: Eine erste Gruppe fasste die Klone aus Israel, der Türkei und Marokko zusammen, eine zweite die Isolate aus Australien und Südafrika. Die brasilianischen Isolate bildeten eine eigene dritte Gruppe und die restlichen Isolate aus Nord-, Mittel- und Südamerika fanden sich in einer gemeinsamen vierten Aufzweigung wieder. In den Dendrogrammen von B. divergens waren keine Isolatgruppen ersichtlich.