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Viertlböck, Birgit (2004): Molekularbiologische und funktionelle Charakterisierung neuer "Chicken Ig-like" Rezeptoren. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Some recently described receptor families on myeloid and lymphoid cells in man and mouse have both inhibitory and activating receptors with important functions in the regulation of the immune system. Due to the lack of information regarding these receptors in other vertebrates, in the present thesis seven new members of this receptor family were identified in the chicken. All receptors identified were located on one single clone of a chicken BAC library, which indicates that they are tightly clustered on the chromosome. This localisation and the high amino acid homology suggests, that they belong to a multigene-family. Analysis of the genomic organisation showed, that the signalpeptide was split into two exons, each Ig-domain and the transmembrane region were encoded by separate exons and the long cytoplasmic tail (in case of inhibitory receptors) was encoded by two exons, the last exon containing the ITIMs. The exon/intron boundaries conformed to the gt-ag rule and the exon phases were highly conserved. In conclusion, the genomic organisation showed conserved features of mammalian Ig-like receptor genes. The novel identified CHIR were grouped into three different types of receptors. The activating CHIR-A had two extracytoplasmic Ig-domains and a short cytoplasmic tail, but a positively charged amino acid in the transmembrane region, which could associate to an ITAM-containing adaptor molecule. CHIR-A2 had a relative molecular weight of ~ 42 kDa and was detected in the mRNA of bursa, spleen, PBL, NK-cells and different macrophage- and B-cell lines. The inhibitory CHIR-B consisted of two Ig-domains and a long cytoplasmic tail with two ITIMs in it. CHIR-B2 had a relative molecular weight of ~ 46 kDa and was only detectable on B-cells by a newly produced specific monoclonal antibody (mAb). Upon Pervanadate treatment the ITIMs in the cytoplasmic tail were phosphorylated and recruited the protein-tyrosine- phosphatases SHP-1 and -2. Additionally ligation of CHIR-B2 had an inhibitory effect on the cell proliferation of a B-cell line. The potentially inhibitory and activating CHIR-AB had one Ig-domain, a long cytoplasmic tail with one ITIM in it and a positively charged amino acid in the trans-membrane region, which could associate with an ITAM-containing adaptor molecule. The only CHIR-AB homologue in the literature is KIR2DL4, that represents a highly conserved Ig-like Receptor expressed on all primate NK-cells with both activating and inhibitory function. CHIR-AB1 had a molecular weight of ~ 40 kDa and its expression on B-cells, on the B-cell line DT-40, on primary macrophages, different macrophage cell lines and on NK-cells in the gut was detected by a specific mAb.

Abstract

Einige vor kurzem identifizierte Rezeptorfamilien auf myeloiden und lymphoiden Zellen bei Mensch und Maus weisen sowohl inhibitorische als auch aktivierende Rezeptoren auf, die wichtige Funktionen bei der Regulation des Immunsystems haben. Nachdem nur wenig über vergleichbare Familien bei anderen Vertebraten bekannt war, wurden in der vorliegenden Arbeit insgesamt sieben neue Vertreter dieser Rezeptorfamilie beim Huhn eingehend charakterisiert. Alle identifizierten Rezeptoren wurden mit Hilfe von PCR-Analyse auf einem Klon einer Hühner-BAC-Bibliothek lokalisiert; das bedeutet, sie liegen eng benachbart auf einem Chromosomenabschnitt. Diese Lokalisation und die hohe AS-Homologie weisen darauf hin, dass es sich um verschiedene Rezeptoren einer Multigenfamilie handelt. Die Analyse der genomische Organisation dieser Rezeptoren zeigte, dass das Signalpeptid auf zwei Exons verteilt war, jede Ig-Domäne durch ein separates Exons kodiert wurde, der transmembrane Bereich auf einem Exon lag und der lange zytoplasmatische Bereich (bei den inhibitorischen Rezeptortypen) durch zwei Exons kodiert wurden, wobei beide ITIMs auf dem letzten Exon lagen. Außerdem folgten die Exon/Intronübergänge der gt-ag Regel und die Phasen der Exons waren hochkonserviert. Die genomische Organisation hatte also eine homologe Struktur zu vergleichbaren Ig-like Rezeptoren beim Säuger. Die sieben neu identifizierten Chicken Ig-like Rezeptoren (CHIR) wurden drei verschiedenen Rezeptortypen zugeordnet. Die aktivierenden CHIR-A besaßen zwei extrazytoplasmatische Ig-Domänen und einen kurzen zytoplasmatischen Anteil, hatten aber im transmembranen Bereich eine positiv geladene AS, die mit einem ITAM-haltigen Adaptormolekül assoziieren könnte. CHIR-A2 hatte ein relatives Molekulargewicht (MR) von ca. 42 kDa und wurde in mRNA von Bursa, PBL, NK-Zellen und verschiedenen Makrophagen- und B-Zelllinien detektiert. Die inhibitorischen CHIR-B besaßen zwei Ig-Domänen und einen langen zyto-plasmatischen Bereich mit zwei ITIMs. CHIR-B2 hatte ein MR von ca. 46 kDa und wurde durch einen neu hergestellten, spezifischen monoklonalen Antikörper (mAk) vor allem auf B-Zellen detektiert. Die ITIMs im zytoplasmatischen Anteil wurden nach Pervanadat-behandlung phosphoriliert und rekrutierten die Protein-Tyrosin-Phosphatasen SHP-1 und -2. Die Stimulation von CHIR-B2 hatte eine hemmende Wirkung auf das Wachstum einer B-Zelllinie. Die potenziell inhibitorischen und aktivierenden Rezeptoren CHIR-AB besaßen eine Ig-Domäne, einen langen zytoplasmatischen Anteil mit einem ITIM und eine positiv geladene AS im transmembranen Bereich, die mit einem ITAM-haltigen Adaptormolekül assoziieren könnte. Der einzige in der Literatur beschriebene Rezeptor, mit einem ähnlichen Aufbau, ist der auf allen NK-Zellen von Mensch und anderen Primaten exprimierte, hochkonservierte KIR2DL4 mit aktivierender und inhibitorischer Wirkung. CHIR-AB1, der ein MR von ca. 40 kDa besitzt, wurde durch einen spezifischen mAk auf B-Zellen, auf der B-Zelllinie DT-40, auf Makrophagen, auf verschiedenen Makrophagenzelllinien und auf NK-Zellen im Darm nachgewiesen.