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Lichtner, Peter (2002): Identifizierung und Charakterisierung von Kandidatengenen aus der DiGeorge Syndrom-Region auf dem kurzen Arm von Chromosom 10. Dissertation, LMU München: Faculty of Chemistry and Pharmacy
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Abstract

Die vorliegende Promotionsarbeit beschäftigt sich vorwiegend mit der Untersuchung von Patienten mit partieller Monosomie 10p. Der Phänotyp dieser Patienten ähnelt häufig dem des DiGeorge-Syndroms. Neben fazialen Dysmorphien und weiteren Nebensymptomen ist die Symptomentrias Herzfehler, T-Zelldefekt und Hypoparathyreoidismus das typische Merkmal dieses Entwicklungsdefektes. Viele Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p zeigen diese Symptome, was für einen DiGeorge-Syndrom-Locus auf Chromosom 10p spricht. Der Hauptlocus für das DiGeorge-Syndrom liegt jedoch auf Chromosom 22q11. Mehr als 90 % der DiGeorge-Syndrom-Patienten haben eine Mikrodeletion 22q11. Diese Mikrodeletion zählt mit einer Frequenz von etwa 1/4000 zu den häufigsten Deletionen beim Menschen überhaupt und ist deshalb schon seit langem das Ziel intensiver Forschungstätigkeit. Dennoch ist es erst in der jüngsten Zeit gelungen, zumindest ein Gen aus der Mikrodeletionsregion 22q11 (TBX-1) zu isolieren, welches für den beobachteten Herzfehler verantwortlich sein könnte. Ansonsten sind die molekularen Ursachen dieses Entwicklunsdefektes noch immer weitgehend unbekannt. Die Deletionen auf Chromosom 10p sind sehr selten. Sie sind aber von wissenschaftlichem Interesse, da die molekulare Aufklärung dieser Region zu einem tieferen Verständnis der Pathogenese des DiGeorge-Syndroms und isolierter Fehlbildungen insgesamt beitragen kann. Im ersten Teil der Arbeit wurden 16 Patienten mit partieller Monosomie 10p zytogenetisch und molekulargenetisch untersucht. Elf dieser Patienten zeigten einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp, fünf Patienten wurden nicht in das DiGeorge-Syndrom-Krankheitsbild eingeordnet. Die Patienten besaßen terminale und interstitielle Deletionen im Größenbereich von 13-48 cM. Mit Hilfe von FISH mit genomischen YAC-, PAC- und BAC-Sonden wurden die Bruchpunktregionen in den Patienten bestimmt. Bei einigen Patienten, bei denen DNA der Eltern vorlag, konnte auch eine Genotypisierung mit polymorphen Markern aus der Region vorgenommen werden. Mittels zweier Patienten konnte eine Haploinsuffizienzregion (DGCR2) kartiert werden, die für den Herzfehler und den T-Zelldefekt verantwortlich sein sollte. Die Region DGCR2 ist um den Marker D10S585 lokalisiert und besitzt eine minimale Ausdehnung von etwa 300 kb. Eine genaue Genotyp-Phänotyp-Analyse unter Einbeziehung von Patienten aus der Literatur zeigte jedoch, daß der gesamte Phänotyp der partiellen Monosomie 10p nicht mit der Haploinsuffizienz nur einer Region erklärt werden konnte, sondern daß zumindest noch ein zweiter Locus (HDR1) deletiert sein mußte. Dieser Locus war mit dem typischen DiGeorge-Syndrom-Symptom des Hypoparathyreoidismus assoziiert. Zusätzlich kartierten in diesen Locus noch eine sensorineurale Taubheit und Nierendefekte. Patienten mit diesen drei Symptomen leiden an einem HDR-Syndrom. Dieser zweite Haploinsuffizienzlocus HDR1 kartiert etwa 3 Mb distal zur Region DGCR2. Im zweiten Teil der Arbeit wurde sowohl über die Region DGCR2 als auch über die HDR1-Region ein PAC/BAC-Contig etabliert. Ausgewählte Klone aus den Contigs wurden im Rahmen des Humangenomprojekts vom Sanger Centre sequenziert. Der dritte Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der molekulargenetischen Untersuchung der beiden Haploinsuffizienzregionen DGCR2 und HDR1. Es konnten 12 EST-Klone in die Region DGCR2 kartiert werden. Bei allen Klonen handelte es sich um Transkripte, die nicht zu funktionellen Proteinen translatiert wurden. Nachdem die genomische Sequenz zugänglich war, konnte eine In-silico-Analyse dieser Region durchgeführt werden. Es handelt sich um eine sehr genarme Region. In die minimale Region DGCR2 kartiert nur das Gen NAPOR, das für ein RNA bindendes Protein kodiert. Es wurde als Kandidatengen für den mit dieser Region assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt näher charakterisiert. Eine Northern-Blot-Hybridisierung zeigte eine Expression in allen aufgetragenen Herzgeweben. Es wurden mindestens sechs verschiedene Transkripte identifiziert, was für die Existenz mehrerer Isoformen des Gens spricht. RNA-in-situ-Hybridisierungen auf Schnitte humaner Embryos und Foeten ergaben eine Genexpression in verschiedenen Geweben beginnend von Embryos des Carnegie-Stadiums C12 bis zu 18 Wochen alten Foeten. Es wurde eine Expression im Thymus vom Carnegie-Stadium C16 an und eine Expression im Herzen bei einem Foetus der 9. Woche beobachtet. Das Expressionsmuster machte NAPOR zu einem guten Kandidatengen für den mit der Haploinsuffizienzregion DGCR2 assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt. Mutationsanalysen in mehr als 100 Patienten ergaben keine Mutationen im NAPOR-Gen. Die meisten untersuchten Patienten besaßen einen DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp waren aber zytogenetisch normal. Besonderer Wert wurde auf die Anwesenheit eines Herzfehlers gelegt. Nur bei etwa 10 % der untersuchten Patienten lag auch eine Thymus-Hypoplasie vor. Ein direkter Beweis für die Beteiligung des NAPOR-Gens am Herzfehler und/oder T-Zelldefekt bei Patienten mit partieller Monosomie 10p steht noch aus. Die HDR1-Region konnte mit Hilfe zweier Mikrodeletionspatienten auf etwa 200 kb eingegrenzt werden. In diese Region kartiert das Gen GATA-3. Mutationsanalysen in zytogenetisch normalen HDR-Patienten zeigten in drei Patienten Mutationen, die zu einem funktionslosen GATA-3-Protein führen. Damit wurde der Beweis erbracht, daß das HDR-Syndrom eine Einzelgenerkrankung ist und daß die Symptome Hypoparathyreoidismus,sensorineurale Taubheit und Nierendefekte bei Patienten mit partieller Monosomie 10p auf eine Haploinsuffizienz des GATA-3-Gens zurückzuführen sind. Zusätzlich zu Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p wurden auch zwei Patienten näher charakterisiert, die eine interstitielle Deletion auf dem Chromosom 14q11-q13 aufwiesen. Diese Region war von Interesse, da das Gen PAX-9 dorthin kartiert und homozygote Pax9 -/- Knockout-Mäuse unter anderem eine Thymus-Hypoplasie und einen Hypoparathyreoidismus zeigen. Die Mäuse haben zwei der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms und stellen eine Beziehung zum Phänotyp der partiellen Monosomie 10p her. Die Deletionsbruchpunktregionen der beiden Patienten wurden über eine Genotypisierung mit polymorphen Markern identifiziert. Mit Hilfe eines Dosis-Blots und einer FISH-Analyse konnte gezeigt werden, daß beide Patienten für PAX-9 hemizygot waren. Beide Patienten zeigen keine Symptome des DiGeorge-Syndroms, was daraufhin weist, daß beim Menschen eine PAX-9-Haploinsuffizienz nicht zu einem DiGeorge-Syndrom ähnlichen Phänotyp führt. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen an Patienten mit partieller Monosomie 10p und an Patienten mit einer interstitiellen Deletion 14q11-q13 lieferten einen Beitrag zur molekulargenetischen Charakterisierung des DiGeorge-Syndroms. Der DiGeorge-Syndrom ähnliche Phänotyp bei vielen Patienten mit einer partiellen Monosomie 10p ist das Resultat eines Contiguous Gene Syndroms, bei dem mindestens zwei unabhängige Regionen (DGCR2 und HDR1) auf Chromosom 10p hemizygot vorliegen müssen. Es wurde gezeigt, daß eine GATA-3-Haploinsuffizienz u.a. zu einem Hypoparathyreoidismus führt, einem der drei Leitsymptome des DiGeorge-Syndroms. Für den mit dem Syndrom assoziierten Herzfehler und T-Zelldefekt wurde mit NAPOR ein gutes Kandidatengen aus der Haploinsuffizienzregion DGCR2 identifiziert und charakterisiert. Eine Haploinsuffizienz des PAX-9-Gens auf Chromosom 14q12 führt zu keinem DiGeorge-Syndrom beim Menschen.