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Neef, Rüdiger (2002): Expression und Funktion des Apoptose-assoziierten Moleküls PHLDA1 im humanen Melanom. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Das Melanom ist aufgrund seiner frühzeitigen und häufigen Metastasierung sowie seiner Resistenz gegenüber Chemotherapeutika einer der bösartigsten Tumoren des Menschen. Trotz dieser großen medizinischen Bedeutung, ist über die molekularen Mechanismen der Tumorigenese und Metastasierung bisher wenig bekannt. Deswegen ist die Identifizierung und Charakterisierung von Genen, die in diesem Prozess eine Rolle spielen, von größter Wichtigkeit. PHLDA1 (pleckstrin homology-like domain family A member 1) wurde in unserem Labor in einer mRNA differential display-Analyse auf der Suche nach Metastasierungs- assoziierten Molekülen im Melanom isoliert. Es ist das humane Homolog zu dem murinen TDAG51, das im Aktivierungs-induzierten Zelltod bei T-Zellen involviert ist. In der vorliegenden Arbeit wurde PHLDA1 charakterisiert und seine Funktion im humanen Melanom beschrieben. Es wurden sechs monoklonale Antikörper gegen PHLDA1 generiert, charakterisiert und die PHLDA1-Expression in der Westernblot-Analyse, in der Immunfluoreszenzfärbung auf lebenden Zellen, sowie immunhistochemisch auf Gewebegefrierschnitten untersucht. Dabei konnten folgende Resultate erzielt werden: In 11 untersuchten Zelllinien aus Melanommetastasen war die PHLDA1-Proteinmenge signifikant geringer (p < 0,0046) als in 17 Zelllinien aus Melanomprimärtumoren. Die verminderte Expression von PHLDA1 ist somit eine typische Eigenschaft von Zelllinien, die aus Melanommetastasen etabliert wurden. In normalem Haut- und Lymphknotengewebe war das PHLDA1-Protein nicht zu detektieren. Dagegen konnte in 55 untersuchten melanozytären Läsionen eine PHLDA1- spezifische Färbung nachgewiesen werden. 80% der benignen Nävi, dagegen nur 41% der Primärtumore und 22% der Metastasen zeigten eine starke und gleichmäßige PHLDA1- Expression. Damit bestätigten die in vivo gemachten Untersuchungen die Resultate aus den Versuchen mit den Zelllinien und zeigen, dass die PHLDA1-Expression während der Tumorprogression des humanen Melanoms vom Primärtumor bis hin zur Metastase herunterreguliert wird. Mit den monoklonalen Anti-PHLDA1-Antikörpern konnte PHLDA1 als zytoplasmatisches Protein lokalisiert werden. Außerdem konnte gezeigt werden, dass der zweite Translationsstartpunkt des offenen Leserahmens von PHLDA1 verwendet wird. Zur Aufklärung der Funktion von PHLDA1, wurden jeweils vier stabile PHLDA1- Transfektanten und zwei Neomycinvektor-Transfektanten in einer Melanomzelllinie und in einer immortalisierten Epithelzelllinie generiert. Die Analyse der klonierten Transfektanten ergab ein langsameres Wachstum der PHLDA1-Transfektanten, eine reduzierte Klonierungseffizienz sowie ein reduziertes Vermögen Kolonien zu bilden. Außerdem zeigten die PHLDA1-Transfektanten während des Wachstums eine stärkere Kontaktinhibition. Die konstitutive PHLDA1-Expression in den stabilen Transfektanten beeinflusste nicht den Zellzyklus. Dagegen konnte sowohl mit Hilfe der Annexin-V-Bindung sowie mit dem TdT-abhängigen Einbau von FITC-markiertem dUTP (tunel-assay) gezeigt werden, dass die basale Apoptoserate in den PHDLA1-Transfektanten erhöht war. Auch die Behandlung mit dem Chemotherapeutikum Doxorubicin erhöhte die Apoptoserate der PHLDA1- Transfektanten signifikant gegenüber der Neomycinvektor-Transfektanten. Um Aufschluss darüber zu bekommen auf welchem molekularen Weg PHLDA1 die Apoptose beeinflusst, wurde nach zytoplasmatischen Interaktionspartnern von PHLDA1 im yeast two hybrid screen gesucht. Dabei konnten aus 5,6x106 gescreenten Hefeklonen einer Gehirn-, einer Plazenta- und einer Hela-Genbank, zwei Gene isoliert werden, die in Hefe spezifisch mit PHLDA1 interagierten. Bei einem Gen handelte es sich um die p47- Untereinheit des humanen Translationsinitiationsfaktor eIF3, bei dem anderen Gen um das MRG-Gen (mammary-derived growth inhibitor-related gene). Translations- initiationsfaktoren werden mit der Blockade der Proteinbiosynthese während der Apoptose in Verbindung gebracht und MRG ist als Gen identifiziert worden, dass eine wachstumsreduzierende Wirkung auf Mammakarzinome ausübt. Ob die beiden Proteine auch die physiologischen Bindungspartner von PHLDA1 sind, ist noch nicht eindeutig geklärt. Das Expressionsmuster von PHLDA1, zusammen mit den funktionellen Ergebnissen, läßt vermuten, dass die starke PHLDA1-Expression in den Nävi für deren gutartigen Charakter mitverantwortlich ist. Im Melanom wird im Verlauf der Tumorprogression die PHLDA1- Expression schrittweise reduziert und korreliert dann mit der zunehmenden Deregulation des Wachstums und der Ausbildung der Apoptoseresistenz. Die Assoziation zwischen der PHLDA1-Expression und Apoptosesensitivität machen PHLDA1 zu einem interessanten Zielgen für die Entwicklung einer effizienteren Chemotherapie beim Melanom.