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Rothbauer, Ulrich (2003): Molekulare Ursachen des Mohr-Tranebjaerg-Syndromes: Untersuchungen zur Struktur und Funktion von DDP1 und Tim13. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

The molecular basis of the Mohr-Tranebjaerg syndrome: A structural and functional analysis of the proteins DDP1 and Tim13 Mohr-Tranebjaerg syndrome is a mitochondrial disorder caused by a defects in the biogenesis of the human TIM23 translocase Tim8 and Tim13 of yeast belong to a family of evolutionary conserved zinc finger proteins that are organised in hetero-oligomeric complexes in the mitochondrial intermembrane space (IMS). The TIM8-13 complex assists the import of Tim23, the major component of the translocase for matrix-targeted proteins. Mutations in DDP1/TIMM8A, the gene encoding the human homolog of Tim8, cause the Mohr-Tranebjaerg syndrome (MTS), a progressive neurodegenerative disorder. This work shows that DDP1 and human Tim13 are zinc binding proteins which together form a 70 kDa complex in the intermembrane space of human mitochondria. Similar to yeast, the human DDP1-hTim13 complex facilitates import of yeast and human Tim23. It has been additionally analysed the structural and functional consequences of a MTS-missense mutation (C66W) directly affecting the conserved Cys4 metal binding motif. In this connection the C66W mutation impairs the ability to bind zinc. As a consequence, the mutated DDP1 loses its ability to assemble into a hetero-oligomeric complex with its partner protein human Tim13. Thus, it was suggested that an assembly defect of DDP1 is the molecular basis of Mohr-Tranebjaerg syndrome in patients carrying the C66W mutation.

Abstract

Molekulare Ursachen des Mohr-Tranebjaerg-Syndromes: Untersuchungen zur Struktur und Funktion von DDP1 und Tim13 Mutationen im TIMM8A/DDP1-Gen verursachen das Mohr-Tranebjaerg-Syndrom (MTS), eine X-chromosomal vererbte neurodegenerative Erkrankung, die durch eine progressive sensorineurale Taubheit, Dystonie, mentale Retardierung und kortikale Blindheit gekennzeichnet ist. Das TIMM8A/DDP1-Gen kodiert für ein kleines mitochondriales Protein, das "deafness dystonia peptide 1" (DDP1), welches strukturelle Ähnlichkeiten zu einer Familie kleiner Zinkfinger-Proteine aufweist, die in der Hefe S.cerevisiae am Import mitochondrialer Innenmembranproteine beteiligt sind. In der Hefe werden fünf Mitglieder dieser Proteinfamilie exprimiert: yTim9, yTim10, yTim12, yTim8 und yTim13. Allen gemeinsam ist ein konserviertes Cys4-Metallbindungs-Motiv, das vermutlich zur Formation eines Zinkfingers beiträgt. Der Mensch kodiert dagegen für sechs kleine Tim-Proteine: ein Tim9-, zwei Tim10- (Tim10a, Tim10b), zwei Tim8- (DDP1, DDP2) und ein Tim13-Homolog. Schwerpunkt dieser Arbeit war die strukturelle und funktionelle Charakterisierung des krankheitsassoziierten DDP1-Proteins. Dabei konnten folgende Ergebnisse erzielt werden: DDP1, wie auch alle anderen im Rahmen dieser Arbeit identifizierten menschlichen kleinen Tim-Proteine, ist als lösliches Protein im mitochondrialen Intermembranraum lokalisiert. In ähnlicher Weise wie die Hefe-Komponenten agieren die menschlichen kleinen Tim-Proteine in Form hetero-oligomerer Komplexe. Das MTS-assoziierte DDP1 assembliert zusammen mit seinem Partnerprotein Tim13 zu einem hetero-hexameren Komplex von 70 kDa. Die Funktion des DDP1/Tim13-Komplexes scheint evolutionär konserviert zu sein, da der in Hefe rekonstituierte menschliche Komplex in der Lage ist, den kältesensitiven Phänotyp einer Dtim8/Dtim13-Deletionsmutante zu komplementieren. In gleicher Weise wie der yTim8/yTim13-Komplex der Hefe unterstützt der menschliche DDP1/Tim13-Komplex den mitochondrialen Import von Tim23-Vorstufenproteinen. Es gibt jedoch Unterschiede in den energetischen Erfordernissen zwischen höheren und niederen Eukaryonten: Während in der Hefe S.cerevisiae der Import von Tim23-Vorstufenproteinen nur bei einem erniedrigten Membranpotential über der Innenmembran durch den yTim8/yTim13-Komplex unterstützt wird (Paschen et al., 2000) ist das humane Tim23-Vorstufenprotein auch unter günstigen energetischen Bedingungen auf die Unterstützung durch den DDP1/Tim13-Komplex angewiesen. Diese Unterschiede können erklären, warum eine in Hefe nicht-essentielle Komponente im Menschen mit einer progressiven neurodegenerativen Erkrankung assoziiert ist. Im Rahmen dieser Arbeit wurden zudem die funktionellen und strukturellen Auswirkungen einer missense Mutation im TIMM8A/DDP1-Gen aufgeklärt. Durch die Mutation wird das dem C-terminus am nächsten gelegene Cystein der vier konservierten Cysteinreste (Cys4-Motiv) des DDP1-Proteins gegen ein Tryptophan ausgetauscht (C66W-Mutation) (Tranebjaerg et al., 2000). Die vier konservierten Cysteinreste vermitteln die koordinierte Bindung von Zinkionen in einem molaren Verhältnis von 1:1, was vermutlich zur Ausbildung einer Zinkfinger-Struktur führt. Die C66W-Mutation hat den vollständigen Verlust der Zinkbindungskapazität des DDP1-Proteins zur Folge. Das DDP1C66W-Protein ist in der Hefe nicht funktionell und kann weder den kältesensitiven Phänotyp noch den Tim23-Importdefekt der Dtim8/Dtim13-Deletionsmutante komplementieren. Der Funktionsverlust scheint auf eine erhöhte Instabilität des mutierten Proteins zurückzugehen. Vermutlich kommt es durch die fehlende Ausbildung einer Zinkfingerstruktur zu einer Miss- bzw. Fehlfaltung des DDP1-Proteins und in Folge zur raschen Degradation im mitochondrialen Intermembranraum. Darüber hinaus hat die Zinkfingerstruktur eine wichtige Funktion für die Interaktion von DDP1 mit seinem Partnerprotein. DDP1C66W ist nicht in der Lage mit Tim13 zu höhermolekularen Komplexen zu assemblieren. Dies kann erklären, warum die in einem MTS-Patienten beschriebene missense Mutation in ihrer Konsequenz - dem Fehlen von DDP1 - nicht von loss-of-function Mutationen, wie Stopmutationen, Insertionen/Deletionen zu unterscheiden ist (Tranebjaerg et al., 2000).