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WH2 domains and actin variants as multifunctional organizers of the actin cytoskeleton
WH2 domains and actin variants as multifunctional organizers of the actin cytoskeleton
Actin is one of the most abundant proteins in eukaryotic cells and regulation of the microfilament system is crucial for a wide range of cellular functions including cell shape, cell motility, cell division and membrane dynamics. The aim of this thesis was (1) to gain a better understanding of the function of distinct actin binding domains in the regulation of the actin cytoskeleton and (2) to elucidate the role of actin variants. WH2 domains (WH2, Wiskott-Aldrich syndrome protein homology 2) are ubiquitous multifunctional regulators of actin dynamics. The protein Spire contains four central WH2 domains A-B-C-D with about 20 amino acids each and the cyclase-associated protein CAP2 contains only one WH2 domain. Under certain conditions, they can (1) nucleate actin polymerization, (2) disintegrate actin filaments and (3) sequester actin monomers. Here, the influence of selected Drosophila melanogaster Spire-WH2 and Mus musculus CAP2-WH2 domain constructs on actin dynamics was tested in vitro. To act as a filament nucleator, at least two WH2 domains are required, and nucleation of actin polymerization was only observed at substoichiometric concentrations of WH2 domains over actin. At higher concentrations, the sequestering activity of WH2 domains takes over. Preformed and purified SpireWH2-actin complexes act as extremely efficient nuclei for actin polymerization, even at superstoichiometric WH2 concentrations, under which free WH2 domains would sequester actin. All analyzed constructs, including these with only a single WH2 domain, sequester actin as well as they can disrupt filaments. This latter and most peculiar behavior of WH2 domains was observed in fluorometric, viscometric and TIRF assays. The WH2 domains seem to have such a high affinity for actin that they can forcefully sequester monomers even from filaments and filament bundles, thus breaking the whole structures. Taken together, the data clearly show that SpireWH2-actin complexes are the intermediates that account for the observed nucleating activity, whereas free WH2 domains can disrupt filaments and filament bundles within seconds, again underlining the intrinsic versatility of this regulator of actin dynamics. These data have been confirmed by crystallography in collaboration with the groups of Prof. Dr. Tad Holak and Prof. Dr. Robert Huber (Martinsried, Germany). Besides the well-studied conventional actins many organisms harbor actin variants with unknown function. The model organism Dictyostelium discoideum comprises an actinome of a total of 41 actins, actin isoforms and actin-related proteins. Among them is filactin, a highly conserved actin with an elongated N-terminus. The 105 kDa protein has a distinct domain organization and homologs of this protein are present in other Dictyosteliidae and in some pathogenic Entamoebae. Here, the functions of filactin were studied in vivo and in vitro. Immunofluorescence studies in D. discoideum localize endogenous and GFP-filactin in the cytoplasm at vesicle-like structures and in cortical regions of the cell. A most peculiar behavior is the stress-induced appearance of full length filactin in nuclear actin rods. To perform in vitro analyses recombinant filactin was expressed in Sf9 cells. Fluorescence studies with the filactin actin domain suggest that it interferes with actin polymerization by sequestering G-actin or even capping filaments. Gel filtration assays propose a tetrameric structure of full length filactin. Protein interaction studies suggest that filactin is involved in the ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) pathway which is responsible for multivesicular body formation. The data on filactin suggest that only the conventional actins are the backbone for the microfilamentous system whereas less related actin isoforms have highly specific and perhaps cytoskeleton-independent subcellular functions., Aktin ist als Bestandteil des Zytoskeletts eines der häufigsten Proteine in allen eukaryontischen Zellen. Eine genaue Regulation des Mikrofilamentsystems ist essentiell für Zellform, Zellmigration, Zellteilung und Membrandynamik. Ziel dieser Arbeit war (1) die Funktion von ausgewählten Aktin Bindedomänen in der Regulation des Aktin Zytoskeletts zu untersuchen und (2) die Funktion von Aktinvarianten zu verstehen. WH2 Domänen (WH2, Wiskott-Aldrich Syndrom Protein Homologie 2) sind kurze, konservierte Sequenzmotive (ca. 20 Aminosäuren), welche bevorzugt monomere Aktinmoleküle binden. Von besonderem Interesse waren Drosophila melanogaster Spire-WH2 und Mus musculus CAP2-WH2 Konstrukte. Das Protein Spire enthält vier WH2 Domänen (A-B-C-D) wohingegen CAP2 (Cyclase-assoziiertes Protein 2) nur eine WH2 Domäne besitzt. Diese WH2 Domänen können unter bestimmten Bedingungen (1) die Aktinpolymerisation stimulieren, (2) Aktinfilamente zerstückeln und (3) Aktinmonomere sequestrieren. Für die Nukleation der Aktinpolymerisation müssen mindestens zwei hintereinander angeordnete WH2 Domänen vorhanden sein und unterstöchiometrische Mengen an WH2 Domänen im Vergleich zur Aktinkonzentration vorliegen. Bei höheren WH2 Konzentrationen überwiegt die Sequestrierungsaktivität. Polymerisationsexperimente mit vorgefertigten SpireWH2-Aktin Komplexen bestätigen, dass diese Komplexe für die beobachtete Nukleation der Aktinpolymerisation verantwortlich sind. Im Gegensatz zu ungebundenen WH2 Domänen sind diese WH2-Aktin Komplexe selbst bei überstöchiometrischen WH2 Konzentrationen äußerst effiziente Nukleatoren. Alle untersuchten WH2 Konstrukte zeigen die bereits bekannte Bindung an G-Aktin, können aber auch vorgeformte Aktinfilamente sogar auseinanderreißen. Diese letztere und besonders auffällige Eigenschaft von WH2 Domänen wurde in fluorometrischen, viskometrischen und TIRF Experimenten nachgewiesen. Anscheinend ist die Affinität der WH2 Domänen zu Aktinmonomeren so stark, dass sie diese aus den Filamenten entfernen können und damit ganze Filamente und Filamentbündel zerstückeln. Für die Multifunktionalität der analysierten konservierten WH2 Domänen spricht zusammenfassend, dass sie neben der Aktinfilament Nukleation auch Filamente und Filamentbündel innerhalb von Sekunden fragmentieren können. Diese Daten wurden in Kollaboration mit den Gruppen Prof. Dr. Tad Holak und Prof. Dr. Robert Huber (Martinsried) durch kristallographische Versuchsansätze bestätigt. Neben den gut untersuchten konventionellen Aktinisoformen liegen oft auch Aktinvarianten vor, deren Funktion bisher unbekannt ist. Der Modellorganismus Dictyostelium discoideum besitzt mit seinen 41 Aktinen und Aktin-verwandten Proteinen ein umfangreiches „Aktinom”. Dazu gehört auch das Protein Filaktin (105 KDa), eine besonders außergewöhnliche Aktinvariante, die neben der konservierten Aktin-ähnlichen Domäne zusätzlich einen verlängerten N-Terminus mit einer definierten Domänenstruktur besitzt. Homologe von Filaktin wurden bisher in Dictyosteliden und einigen pathogenen Entamoeben identifiziert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Funktionen von Filaktin in vivo und in vitro analysiert. Immunfluoreszenz Experimente zeigen, dass Filaktin mit konventionellem Aktin kolokalisiert und zusätzlich im Zytoplasma an Vesikel-artigen Strukturen zu sehen ist. Ein besonderes Merkmal von Filaktin ist zudem, dass es Teil von Stress-induzierten, intranukleären, stäbchenförmigen Proteinaggregaten, sogenannten „nuclear rods” ist. Für umfassende in vitro Experimente wurden rekombinante Filaktin Konstrukte mithilfe von Sf9 Insektenzellen exprimiert. Die Ergebnisse von fluorometrischen und viskometrischen Experimenten deuten darauf hin, dass die Aktin Domäne von Filaktin Aktinmonomere sequestrieren oder sogar Aktinfilamente verkappen kann. Gelfiltrationsexperimente ergaben zusätzlich, dass Filaktin wohl als Tetramer vorliegt. Außerdem verbinden Protein-Interaktionsstudien Filaktin mit dem ESCRT Signalweg (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport), der unter anderem bei der Entstehung von multivesikulären Körpern wichtig ist. Zusammengefasst besteht das Mikrofilamentsystem vermutlich hauptsächlich aus konventionellen Aktinen, wohingegen spezielle Aktinvarianten andere zusätzliche und sogar Zytoskelett-unabhängige Funktionen übernehmen können.
Not available
Gallinger, Julia
2013
Englisch
Universitätsbibliothek der Ludwig-Maximilians-Universität München
Gallinger, Julia (2013): WH2 domains and actin variants as multifunctional organizers of the actin cytoskeleton. Dissertation, LMU München: Fakultät für Biologie
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Abstract

Actin is one of the most abundant proteins in eukaryotic cells and regulation of the microfilament system is crucial for a wide range of cellular functions including cell shape, cell motility, cell division and membrane dynamics. The aim of this thesis was (1) to gain a better understanding of the function of distinct actin binding domains in the regulation of the actin cytoskeleton and (2) to elucidate the role of actin variants. WH2 domains (WH2, Wiskott-Aldrich syndrome protein homology 2) are ubiquitous multifunctional regulators of actin dynamics. The protein Spire contains four central WH2 domains A-B-C-D with about 20 amino acids each and the cyclase-associated protein CAP2 contains only one WH2 domain. Under certain conditions, they can (1) nucleate actin polymerization, (2) disintegrate actin filaments and (3) sequester actin monomers. Here, the influence of selected Drosophila melanogaster Spire-WH2 and Mus musculus CAP2-WH2 domain constructs on actin dynamics was tested in vitro. To act as a filament nucleator, at least two WH2 domains are required, and nucleation of actin polymerization was only observed at substoichiometric concentrations of WH2 domains over actin. At higher concentrations, the sequestering activity of WH2 domains takes over. Preformed and purified SpireWH2-actin complexes act as extremely efficient nuclei for actin polymerization, even at superstoichiometric WH2 concentrations, under which free WH2 domains would sequester actin. All analyzed constructs, including these with only a single WH2 domain, sequester actin as well as they can disrupt filaments. This latter and most peculiar behavior of WH2 domains was observed in fluorometric, viscometric and TIRF assays. The WH2 domains seem to have such a high affinity for actin that they can forcefully sequester monomers even from filaments and filament bundles, thus breaking the whole structures. Taken together, the data clearly show that SpireWH2-actin complexes are the intermediates that account for the observed nucleating activity, whereas free WH2 domains can disrupt filaments and filament bundles within seconds, again underlining the intrinsic versatility of this regulator of actin dynamics. These data have been confirmed by crystallography in collaboration with the groups of Prof. Dr. Tad Holak and Prof. Dr. Robert Huber (Martinsried, Germany). Besides the well-studied conventional actins many organisms harbor actin variants with unknown function. The model organism Dictyostelium discoideum comprises an actinome of a total of 41 actins, actin isoforms and actin-related proteins. Among them is filactin, a highly conserved actin with an elongated N-terminus. The 105 kDa protein has a distinct domain organization and homologs of this protein are present in other Dictyosteliidae and in some pathogenic Entamoebae. Here, the functions of filactin were studied in vivo and in vitro. Immunofluorescence studies in D. discoideum localize endogenous and GFP-filactin in the cytoplasm at vesicle-like structures and in cortical regions of the cell. A most peculiar behavior is the stress-induced appearance of full length filactin in nuclear actin rods. To perform in vitro analyses recombinant filactin was expressed in Sf9 cells. Fluorescence studies with the filactin actin domain suggest that it interferes with actin polymerization by sequestering G-actin or even capping filaments. Gel filtration assays propose a tetrameric structure of full length filactin. Protein interaction studies suggest that filactin is involved in the ESCRT (endosomal sorting complexes required for transport) pathway which is responsible for multivesicular body formation. The data on filactin suggest that only the conventional actins are the backbone for the microfilamentous system whereas less related actin isoforms have highly specific and perhaps cytoskeleton-independent subcellular functions.

Abstract

Aktin ist als Bestandteil des Zytoskeletts eines der häufigsten Proteine in allen eukaryontischen Zellen. Eine genaue Regulation des Mikrofilamentsystems ist essentiell für Zellform, Zellmigration, Zellteilung und Membrandynamik. Ziel dieser Arbeit war (1) die Funktion von ausgewählten Aktin Bindedomänen in der Regulation des Aktin Zytoskeletts zu untersuchen und (2) die Funktion von Aktinvarianten zu verstehen. WH2 Domänen (WH2, Wiskott-Aldrich Syndrom Protein Homologie 2) sind kurze, konservierte Sequenzmotive (ca. 20 Aminosäuren), welche bevorzugt monomere Aktinmoleküle binden. Von besonderem Interesse waren Drosophila melanogaster Spire-WH2 und Mus musculus CAP2-WH2 Konstrukte. Das Protein Spire enthält vier WH2 Domänen (A-B-C-D) wohingegen CAP2 (Cyclase-assoziiertes Protein 2) nur eine WH2 Domäne besitzt. Diese WH2 Domänen können unter bestimmten Bedingungen (1) die Aktinpolymerisation stimulieren, (2) Aktinfilamente zerstückeln und (3) Aktinmonomere sequestrieren. Für die Nukleation der Aktinpolymerisation müssen mindestens zwei hintereinander angeordnete WH2 Domänen vorhanden sein und unterstöchiometrische Mengen an WH2 Domänen im Vergleich zur Aktinkonzentration vorliegen. Bei höheren WH2 Konzentrationen überwiegt die Sequestrierungsaktivität. Polymerisationsexperimente mit vorgefertigten SpireWH2-Aktin Komplexen bestätigen, dass diese Komplexe für die beobachtete Nukleation der Aktinpolymerisation verantwortlich sind. Im Gegensatz zu ungebundenen WH2 Domänen sind diese WH2-Aktin Komplexe selbst bei überstöchiometrischen WH2 Konzentrationen äußerst effiziente Nukleatoren. Alle untersuchten WH2 Konstrukte zeigen die bereits bekannte Bindung an G-Aktin, können aber auch vorgeformte Aktinfilamente sogar auseinanderreißen. Diese letztere und besonders auffällige Eigenschaft von WH2 Domänen wurde in fluorometrischen, viskometrischen und TIRF Experimenten nachgewiesen. Anscheinend ist die Affinität der WH2 Domänen zu Aktinmonomeren so stark, dass sie diese aus den Filamenten entfernen können und damit ganze Filamente und Filamentbündel zerstückeln. Für die Multifunktionalität der analysierten konservierten WH2 Domänen spricht zusammenfassend, dass sie neben der Aktinfilament Nukleation auch Filamente und Filamentbündel innerhalb von Sekunden fragmentieren können. Diese Daten wurden in Kollaboration mit den Gruppen Prof. Dr. Tad Holak und Prof. Dr. Robert Huber (Martinsried) durch kristallographische Versuchsansätze bestätigt. Neben den gut untersuchten konventionellen Aktinisoformen liegen oft auch Aktinvarianten vor, deren Funktion bisher unbekannt ist. Der Modellorganismus Dictyostelium discoideum besitzt mit seinen 41 Aktinen und Aktin-verwandten Proteinen ein umfangreiches „Aktinom”. Dazu gehört auch das Protein Filaktin (105 KDa), eine besonders außergewöhnliche Aktinvariante, die neben der konservierten Aktin-ähnlichen Domäne zusätzlich einen verlängerten N-Terminus mit einer definierten Domänenstruktur besitzt. Homologe von Filaktin wurden bisher in Dictyosteliden und einigen pathogenen Entamoeben identifiziert. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurden die Funktionen von Filaktin in vivo und in vitro analysiert. Immunfluoreszenz Experimente zeigen, dass Filaktin mit konventionellem Aktin kolokalisiert und zusätzlich im Zytoplasma an Vesikel-artigen Strukturen zu sehen ist. Ein besonderes Merkmal von Filaktin ist zudem, dass es Teil von Stress-induzierten, intranukleären, stäbchenförmigen Proteinaggregaten, sogenannten „nuclear rods” ist. Für umfassende in vitro Experimente wurden rekombinante Filaktin Konstrukte mithilfe von Sf9 Insektenzellen exprimiert. Die Ergebnisse von fluorometrischen und viskometrischen Experimenten deuten darauf hin, dass die Aktin Domäne von Filaktin Aktinmonomere sequestrieren oder sogar Aktinfilamente verkappen kann. Gelfiltrationsexperimente ergaben zusätzlich, dass Filaktin wohl als Tetramer vorliegt. Außerdem verbinden Protein-Interaktionsstudien Filaktin mit dem ESCRT Signalweg (Endosomal Sorting Complexes Required for Transport), der unter anderem bei der Entstehung von multivesikulären Körpern wichtig ist. Zusammengefasst besteht das Mikrofilamentsystem vermutlich hauptsächlich aus konventionellen Aktinen, wohingegen spezielle Aktinvarianten andere zusätzliche und sogar Zytoskelett-unabhängige Funktionen übernehmen können.