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Son, Hyunju (2003): Cloning and characterisation of a Dictyostelium STE20-like protein kinase DST2. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

In this study a new Dictyostelium STE20-like protein kinase DST2 (Dictyostelium STE20-like kinase 2) was cloned and characterised. STE20 (Sterile 20) kinase was first identified in yeast as a pheromone-induced serine/threonine protein kinase that acts upstream of a MAP kinase cascade. Based on the domain structure, DST2 belongs to the GCK subfamily of STE20-like protein kinases, which include the mammalian STE20-like kinases (MST1/2/3), oxidant stress response kinase SOK-1, and DST1 in Dictyostelium discoideum which phosphorylates severin, a gelsolin-like F-actin fragmenting protein. DST2 was discovered by screening of the D. discoideum cDNA project database using DST1 as query. To confirm the existence of the DST2 gene and its expression, Southern, Northern and Western analyses of DST2 were carried out. It revealed that DST2 may have two copies in the Dictyostelium genome and that DST2 was expressed during all stages of D. discoideum development. In vitro kinase assays with bacterially expressed fusion protein of full length DST2 (aa461), the catalytic domain (aa287) and the regulatory domain (aa174) showed that autophosphorylation of DST2 occurson the regulatory domain and phosphorylates severin in the presence of a Mn2+ or Mg2+. Purified catalytic domain of PKA phosphorylated the regulatory domain of DST2 and caused an increase in the basal autophosphorylation activity of DST2, suggesting that PKA may be a potential upstream kinase of DST2 through the phosphorylation of its regulatory domain. To understand the function of the non-catalytic domain of DST2, three C-terminal truncation constructs (aa1-421, aa1-368 and aa1-326) were used in comparison to full length DST2 in in vitro kinase assays. Deletion of C-terminal regions revealed an inhibitory region amino acids 326-461 of DST2. Gel filtration chromatography showed that DST2 was eluted in a broad peak ranging from approximately 63 kDa to 400 kDa, suggesting that DST2 may exist in vivo as a monomer as well as a high molecular weight complex. The influence of phosphorylated and unphosphorylated severin on F-actin solutions was investigated using falling-ball viscometry and fluorescence spectroscopy. It turned out that phosphorylation by DST2 inhibits the F-actin fragmenting activity of severin, suggesting that DST2 may be directly involved in actin-cytoskeleton rearrangements.

Abstract

In der vorliegenden Studie wird die Klonierung und Charakterisierung einer neuen STE20-ähnlichen Proteinkinase aus Dictyostelium discoideum beschrieben. STE20-Kinasen wurden zuerst in Hefe gefunden und stellen eine Hauptgruppe der p21-aktivierten Proteinkinasen dar. Die Domänenstruktur der Dictyostelium STE20-ähnlichen Kinase DST2 zeigt, dass sie der GCK Untergruppe ("germinal center kinases") zuzuordnen ist. Typische Vertreter dieser Untergruppe sind die "mammalian STE20-like kinases" MST1/2/3, die durch oxidativen Stress induzierte humane Kinase SOK-1, und auch DST1, eine homologe Kinase aus Dictyostelium. DST2 wurde beim Durchsuchen der D. discoideum cDNA Datenbanken gefunden. Zunächst wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit das entsprechende Gen mit Hilfe von Southern Analysen, sowie die Expression durch Northern und Western Experimente untersucht. Es stellte sich heraus, dass es im Dictyostelium Genom wohl zwei Kopien für DST2 gibt und dass das Protein in allen Stadien der Dictyostelium Entwicklung vorhanden ist. In vitro Kinase-Assays mit bakteriell exprimiertem Fusionsprotein (gesamte Kinase, katalytische oder regulatorische Domäne) zeigten, dass die Autophosphorylierung von DST2 in der regulatorischen Domäne stattfindet und dass die Phosphorylierung von Severin auch durch Mn2+ beeinflusst werden kann. DST2 ist in vitro außerdem ein Substrat der PKA, die DST2 in der regulatorischen Domäne phosphoryliert und dadurch die basale Aktivität der Autophosphorylierung erhöht. Dieser Befund lässt vermuten, dass PKA in vivo möglicherweise stromaufwärts der DST2 auf die Regulation dieses Signalweges Einfluss nimmt. Zum besseren Verständnis der regulatorischen Domäne in DST2 wurden C-terminal verkürzte Konstrukte hergestellt (As 1-421, As 1-368, As 1-326) und mit der Aktivität der kompletten DST2 in in vitro Assays verglichen. Es stellte sich heraus, dass der C-Terminus die katalytische Aktivität der Kinase inhibiert. In der Gelfiltration konnte kein eindeutiges Molekulargewicht der Kinase festgestellt werden, in der Regel wurde die Kinase in einem breiten Peak zwischen 400,000 - 63,000 eluiert. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass DST2 in vivo sowohl als Monomer als auch als hochmolekularer Komplex vorliegen kann. Durch Viskosimetrie- und Fluoreszenzmessungen konnte nachgewiesen werden, dass Severin in seiner F-Aktin fragmentierenden Aktivität durch Phosphorylierung gehemmt wird. Dieses Ergebnis lässt vermuten, dass DST2 möglicherweise direkt am dynamischen Umbau des Aktin-Zytoskeletts beteiligt ist.