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Herzog, Mario (2012): Thermophoresis and cooperative binding of nucleotides. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Thermophorese beschreibt die von Temperaturegradienten angetriebene, gerichtete Bewegung von Partikeln. Obwohl dieser Effekt seit 1856 bekannt ist, werden die zugrundeliegenden Prinzipien immer noch aktiv diskutiert. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein lange vorhergesagter größenabhängiger Übergang der Thermophorese zum ersten Mal experimentell verifiziert. Die Experimente untersuchen ein sphärisches Kondensator Modell für Thermophorese. Um Vorhersagen über ionisches Abschirmen geladener Partikel zu testen, sind Nanopartikel erforderlich, deren Größe im Bereich der Debye Länge liegt: DNA und RNA Oligonucleotide. Der theoretisch prognostizierte Übergang vom Plattenkondensator- über das sphärische Kondensator- bis hin zum isolierte Sphäre-Modell wurde über einen weiten Bereich von Verhältnissen zwischen Partikelgröße und Debye Länge erfolgreich beobachtet. Die Kombination dieser ionischen Thermophorese mit einer etablierten Beschreibung der Temperaturabhängigkeit von Thermophorese von ungeladenen Partikeln reicht aus, um Thermophorese von einzel- und doppelsträngiger DNA und RNA von 5°C bis 75°C und unter Salzkonzentrationen von 0.5mM bis 500mM abzudecken. Dies umfasst einen Großteil biologisch relevanten Bedingungen. Damit lassen sich nicht triviale Abhängigkeiten der Thermophorese in sehr breiten Bereichen von Salzkonzentration und Temperaturen für hoch relevante DNA und RNA Längen mit dem bestätigten Modell vorausberechnen. Diese Experimente geben neue Impulse in der Diskussion über die Rolle von sekundären elektrischen Feldern bei der Thermophorese. Zudem kann dieses neu gewonnene theoretische Verständnis die Quantifizierung von Biomolekülaffinitäten verbessern. Kooperatives Binden, das im zweiten Teil untersucht wird, ist entscheidend für das Verständnis vieler intrazellulärer Prozesse wie z.B. der Transkription. Mithilfe von Thermophoresemessungen wird das komplette Bindungsverhalten von mehr als zwei Partnern inklusive der kooperativen Effekte untersucht, die komplexe Molekül-Interaktionen formen. Die hier präsentierte, neu entwickelte Prozedur ist sehr flexibel und setzt nur einen fluoreszierzmarkierten Bindungspartner voraus. Im Gegensatz zu Methoden, die auf der Sättigung einer Bindung bei gleichzeitiger Untersuchung einer anderen beruhen, macht dieser neue Ansatz viele zusätzliche kooperative Molekülsysteme zugänglich. Kooperatives Binden eines sternförmigen, dreiteiligen DNA-Komplexes wird mit einer einzigen Messung aufgedeckt. Bindungskonstanten und thermophoretische Eigenschaften der Komplexe werde mit Messungen von Titrationsreihen innerhalb des Konzentrationswürfels untersucht. Diese Methode kann zu einer bisher fehlenden, flexiblen Messtechnik für kooperative Effekte bei geringer Veränderungen der untersuchten Systeme werden.

Abstract

Thermophoresis describes the directed motion of particles induced by a temperature gradient. Although the effect is known since 1856, the fundamental principles giving rise to it are still under active debate. In the first part of this thesis, a long predicted size dependent transition in thermophoresis is experimentally verified for the first time. Experiments probe a spherical capacity model of thermophoresis. To test predictions modelled on ionic shielding of charged particles, nano-scale particles are required that are comparable to the Debye length in size. DNA and RNA oligonucleotides fulfil this requirement and are thus used. The theoretically predicted transition from a planar, over a spherical capacitor towards an isolated sphere model was successfully observed in measurements covering a wide range of particle size to Debye length ratios. Combining the ionic thermophoresis contribution with an established description of the temperature dependence of thermophoresis for uncharged particles is sufficient to account for the thermophoresis of single and double-stranded DNA and RNA samples from 5°C up to 75°C and salt strengths from 0.5mM up to 500mM. This covers a broad range of biologically relevant conditions. As a result, non-trivial dependencies of thermophoresis for a very large range of salt concentrations and temperatures for critical DNA and RNA lengths can be predicted with the confirmed model. The experiments give new impulses to the discussion regarding the role of secondary electrical fields in thermophoresis. These results allow for a better quantitative understanding of thermophoresis on a microscopic level. Moreover, this added theoretical understanding is further optimizing the quantification of biomolecule affinity. Cooperative binding, investigated in the second part, is crucial to the understanding of many cellular processes, e.g. transcription. Thermophoretic measurements are used to probe the complete binding behaviour of more than two partners and derive the strengths of the cooperative effects defining the complex molecule interactions. The newly developed procedure, which is presented here, is very flexible and only requires one fluorescently labeled binding partner. In contrast to other methods, this novel approach does not rely on the possibility to saturate one of the interactions, while being free to probe another, and thus gives access to a much wider range of cooperative molecule systems. The cooperative binding of a star-shaped three-molecule DNA-complex is revealed in a single measurement. Binding constants and thermophoretic properties of bound complexes are reconciled with measurements along titration series throughout the concentration cube. This measurement has the potential to fill the need for a flexible tool to quantify cooperative effects with only minute alterations of the investigated system.