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Striebinger, Hannah (2012): Membran-assoziierte Protein-Protein-Interaktionen des Herpes simplex-Virus 1. Dissertation, LMU München: Faculty of Medicine
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Abstract

Herpesviren umfassen eine große Gruppe von human- sowie tierpathogenen Erregern. Auf Grund ihrer hohen Durchseuchungsrate und Fähigkeit zur Etablierung einer latenten Infektion stellen humane Herpesviren vor allem für immunsupprimierte Patienten eine ernsthafte Bedrohung dar. Deshalb ist eine umfassende Aufklärung des viralen Replikationszyklus für die Entwicklung von antiviralen Therapiestrategien zwingend erforderlich. Besonders die membran-assoziierten Vorgänge der Virionmorphogenese - primäre Umhüllung an der inneren Kernmembran mit darauffolgendem Verlust der Virushülle an der äußeren Kernmembran sowie sekundäre Umhüllung an cytoplasmatischen Membranen - sind nur unvollständig entschlüsselt. Um das komplexe Zusammenspiel der viralen Proteine während des Replikationszyklus an den verschiedenen zellulären Membranen aufzudecken, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine genomweite Analyse der Protein-Protein-Interaktion (PPI) der durch Herpes simplex-Virus 1 (HSV-1) kodierten Membranproteine durchgeführt. Außerdem lieferte die Identifizierung von PPI zwischen dem HSV-1 Proteom und Untereinheiten der zellulären ESCRT-Maschinerie (endosomal sortingcomplex required for transport) weitere Belege für die Ausbeutung von Wirtsfaktoren durch das Virus zur Knospung der Partikel. Zur Detektion der genomweiten PPI sowohl intraviral als auch zwischen Virus und Wirt wurde das Hefe-2-Hybridsystem (Y2H) im Hochdurchsatz angewandt. Beide Datensätze konnten eine Vielzahl neuer PPI aufdecken und somit eine solide Grundlage für Interaktionsnetzwerke und zukünftige funktionale Studien schaffen. Auch wurde duch das breite Interaktionsspektrum des Virus mit den z.T. funktionell redundanten ESCRT-Proteinen erneut veranschaulicht, wie die Nutzung flexibler Strategien zur Stabilität des HSV-1 beiträgt. Anhand der Y2H-Analysen wurde ein virales Membranprotein als interessanter Kandidat zur funktionalen Charakterisierung ausgewählt. Glykoprotein M (gM/UL10) von HSV-1 ist ein Typ-III Transmembranprotein, das während der Infektion in verschiedenen Membrankompartimenten lokalisiert. Obwohl evolutionär konserviert, ist es zumindest für HSV-1 nicht-essenziell und seine molekulare Funktion unklar. Auch die funktionale Relevanz einiger potenzieller trafficking Motive von gM ist noch nicht aufgeklärt. In dieser Studie konnte gezeigt werden, dass das targeting von gM zum trans-Golgi Netzwerk (TGN) unabhängig von anderen viralen Faktoren sowie seinen potenziellen C terminalen trafficking Motiven erfolgt und keiner Homooligomerisierung bedarf. Erstaunlicherweise führt die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (gMΔC) zu seiner Retention im ER, wohingegen der Vorwärtstransport durch eine kurze, nicht-verwandte Sequenz wiederhergestellt wurde. Demzufolge enthält die C-terminale Domäne von gM wahrscheinlich keine Sequenzinformation für das targeting vom ER zum Golgi-Apparat, jedoch scheint die Faltung und Integrität des Proteins dafür von Bedeutung zu sein. Im Kontext der Virusinfektion führte die Deletion der C-terminalen Domäne von gM (HSV-1 gMΔC) zur Akkumulation von nicht-umhüllten Partikeln im Cytoplasma, verminderter Freisetzung von Viruspartikeln und in ihrer Infektiosität beeinträchtigten reifen Virionen. Alle Effekte wurden durch eine Revertante wieder aufgehoben und sind demnach spezifisch. Im Gegensatz dazu zeigten zwei zusätzliche Mutanten, HSV-1 ΔgM mit einem frühzeitigen Stoppcodon an Position 3 von UL10 und gMΔac ohne potenzielle trafficking Motive, Wildtyp-ähnliche Wachstumskinetiken. Daraus lässt sich schließen, dass zwar gM entbehrlich ist, gMΔC jedoch einen dominant-negativen Effekt ausübt. Daher wird eine Beteiligung der N-terminalen Bereiche von gM (Aminosäuren 1-361) an der Rekrutierung von viralen und/oder zellulären Faktoren zum Ort der sekundären Umhüllung postuliert. Diese Daten enthüllen neue unbekannte Eigenschaften von HSV-1 gM.

Abstract

Herpesviruses comprise a large group of pathogens infecting both humans and animals. Due to their high frequency of infection and ability to establish latent infections, human herpesviruses are a serious threat especially for immunosuppressed patients. Therefore, the comprehensive understanding of the herpesviral replication cycle is mandatory for the development of antiviral therapeutic strategies. The membrane-associated steps in virion morphogenesis, such as primary envelopment and subsequent loss of this envelope at both nuclear leaflets as well as secondary envelopment at cytoplasmic membranes, are of particular interest as only partially elucidated. To reveal the complex interplay of viral proteins during replication at diverse cellular membranes, a genome-wide analysis of protein-protein-interactions (PPI) regarding membrane proteins encoded by Herpes simplex virus-1 (HSV-1) was carried out in this study. In addition, identification of PPI among HSV-1 proteome and subunits of the cellular ESCRT-machinery (endosomal sorting complex required for transport) provided further evidence for viral hijacking of host factors to perform viral budding. In order to detect both genome-wide intraviral as well as virus-host PPI, the yeast-2-hybridsystem (Y2H) was applied in a high-throughput fashion. Either dataset uncovered a multitude of new PPI, serving as a solid foundation for interaction networks and future functional studies. Also, the broad spectrum of viral interactions with ESCRT-proteins that are to some extent of functional redundance illustrates once again how the use of flexible strategies contributes to the stability of HSV-1. On the basis of this Y2H-analysis, a viral membrane protein was selected as interesting candidate for functional characterisation. Glycoprotein M (gM/UL10) of HSV-1 is a type-III transmembrane protein reported to be present at various membrane compartments during infection. Although evolutionarily conserved, HSV-1 gM is non-essential and its molecular function unclear. Also the functional relevance of several potential trafficking motifs encoded by gM has yet to be elucidated. This study could show that targeting of gM to the trans-Golgi network (TGN) occurs independent of other viral factors, of the potential C-terminal trafficking motifs, and does not involve homo-oligomerization. Surprisingly, deletion of the C-terminal domain of gM (gMΔC) caused its ER retention, whereas forward transport was rescued by a short unrelated tail. Hence, the C-terminal domain of gM is unlikely to contain sequence information for ER to TGN targeting, but protein folding and integrity seem to be of importance. In the context of viral infection, the deletion of the C-terminal domain of gM (HSV-1 gMΔC) led to accumulation of unenveloped cytoplasmic particles, reduced egress of viral particles and mature virions compromised in infectivity. These effects were specific, as not observed for the revertant virus strain. On the contrary, two additional viral mutants, HSV-1 ∆gM carrying a premature stop codon at position 3 of the UL10 gene as well as the gM∆ac virus missing all predicted trafficking motifs, displayed wildtype-like growth kinetics. In conclusion, gM is fully dispensable but gM∆C exhibits a dominant effect. Thus, a role for the N-terminal domains of gM (residues 1-361) in the recruitment of viral and/or cellular components to the site of final envelopment is postulated. These data elucidate novel unknown characteristics of HSV-1 gM.