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Severin, Philip Magnus Dirk (2012): Modulation der DNA-Mechanik durch Methylierung und Transkriptionsfaktoren. Dissertation, LMU München: Faculty of Physics
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Abstract

Genregulation gibt der Zelle die Kontrolle über Struktur und Funktion, und ist die Basis für zelluläre Differenzierung, Morphogenese und die Vielseitigkeit und Anpassungsfähigkeit von jedem Organismus. Um zu begreifen, wie eine Zelle ihre Funktion organisiert und wie sich ganz individuelle Organismen ausbilden, obwohl die gleichen genetischen Informationen vorhanden sind, muss man die Regulation der Genexpression im Detail verstehen. Diese Regulation wirkt an verschiedenen Stellen der Genexpression und besteht aus einer Vielzahl von komplexen Prozessen, die untereinander verbunden sind. Somit ist das Verständnis der zugrundeliegenden molekularen Mechanismen und ihres Zusammenspiels für Biologie und Biophysik von großer Bedeutung. Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung von Wechselwirkungen und Wechselwirkungskräften zwischen Biomolekülen, die an der Genregulation und der Epigenetik, auf der Ebene der Transkription beteiligt sind. Insbesondere konnten Protein-DNA-Wechselwirkungen und der Einfluss epigenetischer DNA-Modifikationen quantifiziert werden. Für die Messungen wurde ein molekularer Kraftsensor und als dessen Erweiterung ein molekularer Analog-Digital-Wandler entwickelt. Diese molekularen Sensoren ermöglichen die direkte Messung der Wechsel- wirkungskräfte zwischen DNA und Liganden. Mit dem molekularen Kraftsensor können außerdem hochparallel Messungen durchgeführt werden, wobei durch den symmetrischen, molekularen Aufbau zudem eine sehr hohe Sensitivität erreicht wird. Die Verwendung dieser Methode ermöglichte es, den Einfluss der epigenetisch modifizierten Basen Methylcytosin und Hydroxymethylcytosin („5. und 6. Base der DNA“) auf die mechanische Stabilität der DNA- Doppelhelix zu untersuchen. Es wird gezeigt, dass mit dem aus DNA-Oligomeren aufgebauten molekularen Kraftsensor Protein-DNA-Wechselwirkungen detektiert und deren Dissoziationskonstanten bestimmt werden können. Unter anderem wird die Wechselwirkung der Endonuklease EcoRI mit ihrer DNA- Erkennungssequenz quantifiziert. Hierfür wurden molekulare Kraftsensoren in Zipper- und Scher-Geometrie entworfen. Bei dem neu entwickelten Aufbau des Kraftsensors mit integriertem Förster-Resonanzenergietransfer-Farbstoffpaar genügt schon eine Fläche von 25 !m2, um die Stärke von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmen zu können. Diese Fläche liegt deutlich unterhalb der Messfleckgröße aktueller DNA-Mikroarrays. Damit erfüllt der molekulare Kraftsensor bezüglich der Messfleckdichte die Voraussetzung für moderne Hochdurchsatz- Methoden. In einem zweiten Schritt wird der molekulare Kraftsensor zu einem „molekularen Analog- Digital-Wandler“ erweitert. In Analogie zum elektronischen Flash-Analog-Digital-Wandler, bei dem mehrere Komparatoren mit unterschiedlichen Referenzschaltungen parallel geschaltet sind, werden beim molekularen Analog-Digital-Wandler parallel räumlich getrennte, molekulare Kraftsensoren mit unterschiedlich stabilen Referenz-Wechselwirkungen zur Bestimmung einer unbekannten molekularen Wechselwirkung verwendet. Durch eine Kompensationsmessung wird dann die Kraft von Ligand-DNA-Wechselwirkungen bestimmt. Es werden die Wechsel- wirkungen eines Pyrrol-Imidazol Hairpin-Polyamides, der Endonuklease EcoRI und des Transkriptionsfaktors p53 zur jeweiligen DNA-Erkennungssequenz vermessen. Eine hoch- parallele Version mit Messfleckgrößen mit einem Durchmesser von minimal 15 !m konnte realisiert werden. Abgeleitet vom Bell-Evans-Modell wurde ein analytisches Modell zur Beschreibung des molekularen Analog-Digital-Wandlers entwickelt. Neben den Protein-DNA-Wechselwirkungen werden die epigenetisch modifizierten DNA- Basen Methylcytosin (mC) und Hydroxymethylcytosin (hmC) untersucht. Es wird der Nachweis erbracht, dass sich die mechanische Stabilität der DNA-Doppelhelix bei Separation in zwei Einzelstränge in beiden Fällen signifikant um mehrere Pikonewton ändert. Die Stärke des Effekts ist abhängig von der DNA-Sequenz und der Richtung der angelegten Kraft. Durch Einzelmolekül-Kraftspektroskopie wird eine Reduzierung der Potentialweite durch mC aufgezeigt. Außerdem konnte mit Hilfe von Molekulardynamik-Simulationen der Effekt für mC und teilweise auch für hmC auf molekularer Ebene aufgeklärt werden. Es wird ein Modell entwickelt, das erklärt, wie dieser Effekt einen Einfluss auf die Genregulation ausüben kann.