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Stein, Katrin (2011): Entwicklung einer Realtime-PCR zum Nachweis von Mycobacterium avium ssp. avium und Mycobacterium avium ssp. silvaticum beim Vogel. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Infektionen mit Mykobakterien sind beim Vogel weit verbreitet. Am häufigsten werden die Subspezies M. avium ssp. avium und M. avium ssp. silvaticum nachgewiesen, die schwere chronische Erkrankungen bei einem breiten Spektrum von Vogelarten verursachen. Außerdem muss von einem zoonotischen Potential dieser Keime ausgegangen werden. Da die Mykobakteriose beim Vogel letztlich immer zur Erregerausscheidung führt und meist letal verläuft, ist es insbesondere zur Infektionsprophylaxe in Beständen wichtig, eine Infektion frühzeitig und sicher diagnostizieren zu können. Für die Diagnostik standen neben einer serologischen Untersuchung bisher die Ziehl-Neelsen-Färbung zum Nachweis säurefester Stäbchen und die lang dauernde Anzucht von Mykobakterien aus Organmaterial zur Verfügung. Neuere molekularbiologische Nachweisverfahren können Mykobakterien nur bis auf die Speziesebene differenzieren oder sie sind sehr aufwendig. Insbesondere Kot wurde bisher selten direkt als Ausgangsmaterial für einen Nachweis beim Vogel verwendet. In der vorliegenden Arbeit wurde daher eine Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s. in Organproben und Vogelkot entwickelt. Da vor allem bei Kotproben mit dem Vorkommen von PCR-Inhibitoren zu rechnen ist, wurde zur Qualitätssicherung eine interne Kontrolle in die Extraktion und PCR integriert. Basierend auf den Ergebnissen von Sequenzanalysen von hsp65, der 16SrRNA und von Insertionselementen wurde als Zielgen für die Realtime-PCR das Insertionselement IS901 ausgewählt. Für den Nachweis von M.a.a und M.a.s. wurden anschließend Primer und eine Taqman-Sonde konstruiert, die auf dieses Insertionselement gerichtet sind. Als interne Kontrolle wurde eine Realtime-PCR nach WAKELEY et al. (2006) für Taylorella equigenitalis verwendet und die gesamte Realtime-PCR in Form einer Duplex-PCR konzipiert. Die Reaktionsbedingungen dieser Realtime-PCR wurden anschließend hinsichtlich der Konzentrationen von Magnesiumchlorid, dNTP, Primer und Sonden optimiert. Zur Ermittlung der Spezifität wurden 13 Mykobakterien-Referenzstämme mit dieser PCR untersucht. Zur Ermittlung der Nachweisgrenze und Überprüfung der Sensitivität wurden zudem Kotproben von SPF-Tauben mit Suspensionen aus unterschiedlichen Mykobakterienkonzentrationen gespickt und dann geblindet sowohl mittels Ziehl-Neelsen-Färbung als auch mit der Duplex-Realtime-PCR untersucht. Des Weiteren wurden 27 Organproben, 18 Kotproben sowie 12 asservierte Mykobakterienstämme, die aus Organproben von Vogelpatienten angezüchtet worden waren, einer Testung mittels PCR unterzogen. Bei der Etablierung der internen Kontrolle wurde die DNA-Menge der internen Kontrolle so eingestellt, dass keine Hemmung der PCR für M.a.a und M.a.s auftrat. Die Relevanz der Verwendung dieser internen Kontrolle wurde insbesondere bei der Untersuchung von 18 Kotproben von Vogelpatienten deutlich, bei der in drei Ansätzen bei der Verwendung von unverdünnter DNA aus der Extraktion eine Inhibition der PCR angezeigt wurde. Bei der Untersuchung der Referenz-Stämme wurde eine DNA-Amplifikation anhand eines spezifischen Fluoreszenzsignals nur bei den vogelpathogenen Erregern M.a.a. und M.a.s. nachgewiesen. In der geblindeten Untersuchung von mit M.a.a gespickten Kotproben wurde für die Duplex-Realtime-PCR eine Nachweisgrenze von 104 Mykobakterien pro Gramm Kot ermittelt, was rechnerisch einem Nachweis von 1,25 Mykobakterien pro PCR-Ansatz entspricht. Die mikroskopische Untersuchung nach Ziehl-Neelsen-Färbung zeigte eine höhere Nachweisgrenze mit 105 Mykobakterien pro Gramm Kot als die PCR und erlaubt zusätzlich keine Aussage darüber, ob es sich um vogelpathogene Mykobakterien handelt. Mit der Realtime-PCR wurden alle negativen Ansätze als negativ erkannt. Bei der Untersuchung von klinischem Material von Vogelpatienten (27 Organproben, 18 Kotproben) und von 12 asservierten Mykobakterienstämmen, bei denen vergleichend auch mikroskopische Untersuchungen nach Ziehl-Neelsen-Färbung durchgeführt wurden, wurde bei 32 von 34 Proben mit Nachweis von säurefesten Stäbchen auch DNA von M.a.a./M.a.s. mittels Realtime-PCR festgestellt. Dies belegt die Bedeutung dieser beiden Unterarten als Krankheitserreger für Vögel. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelte Realtime-PCR zum Nachweis von M.a.a. und M.a.s erwies sich als sehr gut für die Diagnostik von klinischem Material und ist somit für die Untersuchung von Vogelpatienten und zur Bestandsuntersuchung geeignet. Insbesondere die in die PCR integrierte interne Kontrolle ist für die Qualitätskontrolle der Diagnostik bedeutend, da, wie hier gezeigt wurde, vor allem Kot- und Darmproben hinsichtlich eines hohen Gehalts an Inhibitoren problematisch sind.

Abstract

Infections with mycobacteria are widespread in birds. The subspecies M. avium ssp. avium and M. avium ssp. silvaticum are most commenly detected. They cause serious chronic diseases in a wide range of bird species. A zoonotic potential of these bacteria must be assumed. Since infections with mycobacteria in birds always lead in shedding these pathogens and have a lethal outcome, an early diagnosis is especially important for preventing transmission of them. At present, diagnosis is mainly based on Ziehl-Neelsen staining detecting acid-fast bacilli and on long lasting cultivation of mycobacteria from organ material as well as on serological tests for the detection of antibodies. Recent molecular biological tests can only differentiate avian mycobacteria to the species level or are very time-consuming. In particular, faeces was rarely used directly as starting material for an analysis. In the present study a real-time PCR for detection of M.a.a. and M.a.s. from organ samples and bird droppings was developed. Since especially in faecal samples the presence of PCR inhibitors had to be expected, an internal control was integrated in the DNA extraction and PCR. Based on the results of sequence analysis of hsp65, 16SrRNA and of insertion elements the insertion element IS901 was selected as target gene for the real-time PCR and primers and a Taqman-probe were designed for the detection of M.a.a and M.a.s. As an internal control, a real-time PCR by Wakeley et al. (2006) for Taylorella equigenitalis was used and the assay was designed in the form of a duplex-PCR. The reaction conditions of this real-time PCR were then optimized with regard to the concentrations of magnesium chloride, dNTP's, primers and probes. To determine the specificity 13 mycobacterial reference strains were tested with this PCR. To determine the detection limit and sensitivity faecal samples from SPF-pigeons were spiked with suspensions of different mycobacteria concentrations, blinded and analyzed by both Ziehl-Neelsen staining and the duplex-real-time PCR. Furthermore, 27 tissue samples, 18 fecal samples and 12 preserved mycobacterial strains that had been cultured from organ samples of bird patients, were tested by PCR. The DNA amount of the internal control was adjusted so that no inhibition of PCR for M.a.a. and M.a.s. occurred. The relevance of the use of this internal control became especially apparent when bird fecal samples from patients were investigated. In three out of 18 batches PCR inhibition was shown with the use of undiluted DNA from extraction. When the reference strains of mycobacteria were tested, specific fluorescent signals indicating DNA amplification were only detected with M.a.a. and M.a.s.. In the blinded analysis of faecal samples spiked with M.a.a. detection limit of the duplex real-time PCR was determined to be 104 mycobacteria per gram of feces, which corresponds to a calculated detection of 1.25 bacteria per PCR tube. Microscopic examination after Ziehl-Neelsen staining showed a higher detection limit of 105 mycobacteria per gram of faeces compared with the PCR. In addition this test does not allow a statement about occurrence of mycobacteria pathogenic for birds in the sample. With the real-time PCR, all negative samples were correctly identified as negative. On examination of clinical materials from bird patients (27 organ samples, 18 fecal samples and 12 preserved mycobacterial strains) with microscopic examinations after Ziehl-Neelsen staining in addition to PCR, DNA of M.a.a./M.a.s. was detected in 32 of 34 samples where acid-fast bacilli had been found. This highlights the importance of these two sub-species as pathogens for birds. The real-time PCR for the detection of M.a.a. and M.a.s. presented here proved to be very appropriate for the investigation of clinical materials and thus to be suitable for the examination of bird patients and herds. In particular, the integrated internal control is an important tool for the quality control of diagnosis, since, as shown here, especially feces and intestinal samples are problematic with respect to a high content of inhibitors.