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Israel, Lars (2003): Domänenanalyse des Cyclase-assoziierten Proteins (CAP) und Charakterisierung von Filactin, einem neuartigen actinähnlichen Protein aus Dictyostelium discoideum. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

The cyclase-associated protein (CAP) from Dictyostelium discoideum was studied in detail regarding its structure and function relationships. The second part of the thesis describes the characterization of the novel actin-related protein filactin from D. discoideum. CAP homologs are multifunctional proteins: they are involved in signal dependent changes in the actin cytoskeleton, in vesicle transport and cell development. The binding of monomeric actin through the C-terminal domain represents a common feature of all CAPs. From four highly conserved regions in this domain the verprolin homology region of the D. discoideum CAP was analyzed in this work. Loss of this region led to a clear decrease, but not suppression of the actin-sequestering activity. In agreement to these data, stable complexes of the modified CAP-C with G-actin could be identified in chemical crosslinking experiments, and it could be shown that CAP-C is able to dimerize. Considering the high conservation of cyclase-associated proteins and their importance for cell biological processes it is remarkable that no structure of this protein has been elucidated so far. Therefore, in the frame of this thesis the structure of the membrane-associated N-terminal domain of D. discoideum CAP was to be determined in cooperation with the group of T. Holak at the MPI f. Biochemistry (Martinsried). For this purpose numerous constructs from the N-terminal domain had to be cloned and expressed, to be purified and examined for their stability and threedimensional folding. It turned out that the stable core of the aminoterminal domain covers the amino acids 51-226. The structure was determined by nuclear magnetic resonance spectroscopy and X-ray crystallography. Six antiparallel a-helices are connected by loop elements and form a cylindrical core domain which can form a dimer in the crystal, dimerization occurs through Mg2+ ions. The clarification of the N-terminal structure of D. discoideum CAP will now simplify the research on its interaction with phospholipids and CAP binding proteins The second part of this work dealt with the characterization of filactin. The unique 105 kDa protein contains two filamin homologous regions in its N-terminal, and a clearly actin-related domain within the C-terminal part. While in resting cells the endogenous filactin shows cytoplasmic distribution and interaction with protein aggregates as well, the GFP construct of the actin-related domain displays an actin-like behavior during cell movement or phagocytosis. A stimulus-induced colocalization of actin and filactin was observed in experiments with chemotactically stimulated cells. The alignment of its C-terminal amino acid sequence with the structure of muscle actin predicts a globular, actin-related structure containing all residues that are important for ATP/ADP binding.

Abstract

In dieser Arbeit standen zwei Aufgaben im Mittelpunkt: Zum einen wurde das Cyclase-assoziierte Protein (CAP) aus Dictyostelium discoideum hinsichtlich seiner Struktur-Funktionsbeziehungen eingehend untersucht, zum zweiten erfolgte eine erste Charakterisierung des neuartigen actinähnlichen Proteins Filactin aus D. discoideum. CAP-homologe Proteine sind multifunktionell und entscheidend an signalabhängigen Veränderungen des Actin-Cytoskeletts, am Vesikeltransport und an der Zellentwicklung beteiligt. Die Bindung von monomerem Actin über die carboxyterminale Domäne stellt wahrscheinlich eine gemeinsame Eigenschaft aller Homologen dar. Von vier hochkonservierten Regionen im C-terminalen Abschnitt, die für eine spezifische Bindung in Frage kommen, wurde in dieser Arbeit der Verprolin-homologe Bereich des D. discoideum CAPs untersucht. Der Verlust dieser Domäne führte zwar zu einer deutlichen Senkung, nicht aber Unterdrückung der Actinbindung durch den carboxyterminalen Proteinbereich. Dementsprechend wurden in chemischen Quervernetzungsexperimenten stabile Komplexe des verkürzten CAP-C mit G-Actin erhalten. Durch das Auftreten von CAP-C-Dimeren wurde hier außerdem eine weitere Funktion des Proteins nachgewiesen. Angesichts der weiten Verbreitung der Cyclase-assoziierten Proteine und ihrer Bedeutung für zellbiologische Prozesse ist es bemerkenswert, daß bisher noch keine Struktur dieses Proteintyps veröffentlicht ist. Es sollte daher in Kooperation mit der Gruppe von T. Holak am MPI f. Biochemie (Martinsried) die Struktur der membranassoziierten N-terminalen Domäne von D. discoideum CAP erarbeitet werden. Zu diesem Zweck mußten zunächst zahlreiche Proteinabschnitte aus dem N-terminalen Bereich kloniert und exprimiert, gereinigt und auf ihre Stabilität und dreidimensionale Faltung hin untersucht werden. Es stellte sich heraus, daß der stabile Bereich der aminoterminalen Domäne die Aminosäuren 51-226 umfasst. Nach NMR-spektroskopischen und röntgenkristallographischen Analysen liegt nun die Struktur vor. Danach bilden sechs antiparallel angeordnete und über Loop-Elemente miteinander verbundene a-Helices eine zylindrische Domäne aus, welche im Kristall dimerisiert vorliegt. Pro Dimer wird dabei ein Mg2+ komplexiert. Die Aufklärung der N-terminalen Struktur von D. discoideum CAP erlaubt nun gezielte Untersuchungen hinsichtlich der Interaktion mit Phospholipiden und CAP-Bindeproteinen. Im zweiten Teil der Arbeit stand die Charakterisierung von Filactin im Mittelpunkt. Das bisher einzigartige und etwa 105 kDa große Protein verfügt über zwei Filamin-homologe Bereiche in der N-terminalen Region und eine stark ausgeprägte actinähnliche Domäne im C-terminalen Bereich. Während das endogene Filactin in der ruhenden Zelle sowohl eine cytoplasmatische Verteilung als auch eine Anbindung an bisher unbestimmte Proteinaggregate zeigt, verhält sich das GFP-Konstrukt der actinähnlichen Domäne im Zuge der Zellbewegung oder Phagocytose übereinstimmend mit Actin. Experimente mit chemotaktisch stimulierten Zellen zeigen darüber hinaus auch eine Stimulus-induzierte Kolokalisation von Actin und Filactin. Die Anpassung seiner carboxyterminalen Aminosäurensequenz an die Struktur von Muskelactin sagt für das Protein eine globuläre, actinähnliche Struktur voraus, in der alle für eine ATP/ADP-Bindung erforderlichen Aminosäurenreste vorhanden sind.