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Strasser, Angelika (2003): Entwicklung eines Biosensors zum Nachweis von Antibiotika und Sulfonamiden in Milch- Herstellung der immunchemischen Komponenten. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

This paper describes the development and application of enzyme immunoassays for the detection of antimicrobials in milk, aiming at the establishment of a biosensor system for the on-line analysis of drug residues in milk. For the development of group-specific antibodies against penicillins rabbits were immunized with an ampicillin-BSA-conjugate. The resulting antiserum was employed for the development of a direct competitive enzyme immunoassay (EIA), giving a detection limit of 1 ng/ml for penicillin G in milk. Due to broad cross-reactivities the sensitive detection of those penicillins regulated by MRLs within the European Union (ampicillin, amoxicillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin and nafcillin) was enabled. The practical use of the enzyme immunoassay was demonstrated by analyzing artificially contaminated and violative incurred milk samples (n = 321). For the development of indirect competitive enzyme immunoassays for the detection of streptomycin, sulfonamides and penicillins, previously established direct assays, based on monoclonal antibodies, were adapted to indirect formats. For this purpose a wide range of coating-antigens was prepared by linking haptens to carrier-proteins. After optimizing test sensitivity and characterizing the test specificity indirect EIAs could be developed for each antimicrobial compound, fulfilling the MRL requirements due to EU regulation 2377/90. Only for ampicillin and penicillin G colorimetric measurements resulted in detection limits of 7 and 6 ng/ml, respectively, which were slightly above the MRL of 4 ng/ml. By using a luminescent substrate, however, the MRL could be reached for these antibiotics as well. Based on the results of the individual EIAs rapid multianalyte tests both on microtitre plates and planar microarray chips were developed. Due to altered assay conditions again the systems were optimized and characterized regarding sensitivity and specificity. The sensitivities achieved on the biochip were well comparable with those obtained in the microtitre plate, whereas total assay time could be reduced to 15 min (microtitre plate) and 5 min (biochip), respectively.

Abstract

Die vorliegende Arbeit befaßt sich mit der Entwicklung und Anwendung enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von Antiinfektiva in Milch, die die Grundlage für die Etablierung eines Biosensor-Systems zur "on-line"-Erfassung von Arzneimittelrückständen in Milch darstellten. Zur Gewinnung von gruppenspezifischen Antikörpern gegen Penicilline wurden Kaninchen mit einem Ampicillin-BSA-Konjugat immunisiert. Mit dem erhaltenen Antiserum wurde ein direkter kompetitiver Enzymimmuntest (EIA) entwickelte, der eine Nachweisgrenze von 1 ng/ml für Penicillin G in Milch aufwies. Durch die hohe Gruppenspezifität war zudem die Detektion aller mit einem MRL-Wert belegten Penicilline (Ampicillin, Amoxicillin, Oxacillin, Cloxacillin, Dicloxacillin und Nafcillin) auf bzw. unterhalb der entsprechenden Höchstwerte (4 bzw. 30 ng/ml) möglich. Die praktische Anwendbarkeit des erstellten Enzymimmuntests wurde anhand künstlich kontaminierter Milch sowie positiv getesteter Praxisproben (n = 321) überprüft. Zur Etablierung indirekter kompetitiver enzymimmunologischer Verfahren zum Nachweis von Streptomycin, Sulfonamiden und Penicillinen wurden bereits bestehende, auf monoklonalen Antikörpern basierende, direkte EIAs auf ein indirektes Format umgestellt. Hierfür wurde eine breite Palette an Festphasenantigenen aus den jeweiligen Zielantibiotika und Trägerproteinen synthetisiert. Nach Optimierung der Testempfindlichkeit und Überprüfung der Spezifität, konnten für alle untersuchten Analyten indirekte EIAs entwickelt werden, die die Höchstmengenvorgaben für Antiinfektiva in Milch nach VO (EWG) 2377/90 weitgehend erfüllten. Für Ampicillin und Penicillin G lag die Nachweisgrenze unter Verwendung eines chromogenen Substrates mit 7 und 6 ng/ml oberhalb des MRL-Wertes (4 ng/ml), durch Verwendung eines lumineszierenden Substrates konnte jedoch eine Steigerung der Empfindlichkeit erreicht werden. Basierend auf den optimierten indirekten EIAs wurden Multianalyt-Schnelltests sowohl in der Mikrotiterplatte als auch auf einem Microarray-Chip entwickelt. Aufgrund der geänderten Versuchsbedingungen wurden die Systeme erneut optimiert und hinsichtlich ihrer Sensitivität und Spezifität charakterisiert. Die auf dem Biochip erreichten Empfindlichkeiten standen den auf Mikrotiterplatten erzielten Ergebnissen nicht entscheidend nach, die Testdauer konnte auf 15 min (Mikrotiterplatte) bzw. 5 min (Chip) reduziert werden.