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Korte, Julia (2011): Vergleichende Analyse des Proteoms der Bursa Fabricii des Huhns zu verschiedenen Entwicklungszeitpunkten: Differential proteome analysis of the chicken Bursa of Fabricius at relevant developmental stages. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, molekulare Vorgänge während der B-Zellentwicklung in der Bursa Fabricii des Haushuhns mittels proteomischer Analysen zu charakterisieren. Hierfür wurden zunächst repräsentative Zeitpunkte der bursalen B-Zellentwicklung für die Probengewinnung definiert. Daran schlossen sich qualitative Proteomanalysen der Bursa Fabricii zu den gewählten Entwicklungszeitpunkten Embryonaltag 10 (ET10), Embryonaltag 18 (ET18), Tag 2 und Tag 28 nach dem Schlupf an. Diese erfolgten durch Vorfraktionierung der Proben mittels 1D-SDS-PAGE und nano-HPLC gefolgt von Tandem-MS-Analysen. Hierbei konnten für die bursalen Proteome zu jedem Zeitpunkt zwischen 1152 und 1392 Proteine identifiziert werden (FDR < 1 %). Überschneidungen der einzelnen Zeitpunkte in 537 allgemeinen Struktur- und Stoffwechsel-Proteinen berücksichtigt, wurden insgesamt 2214 verschiedene Proteine identifiziert. Eine zusätzliche qualitative Analyse aufgereinigter bursaler B-Zellen führte zur Identifizierung von 758 Proteinen. Durch genontologische Analysen konnte festgestellt werden, dass für das Zellwachstum verantwortliche Proteine va. zu den frühen Zeitpunkten zu finden waren, während Proteine, welche eine Rolle für das Immunsystem spielen, eher zu späteren Entwicklungszeitpunkten in Erscheinung traten. Dies spiegelt die Entwicklung der Bursa von der unreifen, embryonalen Wachstums- und Differenzierungsprozessen unterliegenden Bursaanlage, zum fertig ausdifferenzierten, primär-lymphatischen Organ auf molekularer Ebene wider. Konform zu den hohen Proliferationsraten der B-Zellen während der Bursaentwicklung fanden sich in den genontologischen Analysen der B-Zellen besonders hohe Anteile an Proteinen, welche für Zellteilung verantwortlich sind. Proteine, welche in Zusammenhang mit Zellmigration stehen, wurden vor allem in der B-Zell-Probe sowie an ET10 gefunden, was als Hinweis auf eine Beteiligung dieser Proteine an der Einwanderung der B-Zellen in die Bursaanlage betrachtet werden kann. Die anschließende quantitative Proteomanalyse wurde zu denselben Entwicklungszeitpunkten an je sechs biologischen Replikaten mittels 2D-DIGE durchgeführt. In der statistischen Auswertung der quantitativen Veränderungen zeigten sich 402 hochsignifikante Unterschiede zwischen den bursalen Proteomen der verschiedenen Entwicklungszeitpunkte, wobei die sehr große Übereinstimmung der Analyseergebnisse innerhalb der biologischen Replikate die gute Reproduzierbarkeit der Experimente belegte. Die deutlichsten Veränderungen zeigten sich zwischen ET10 und allen weiteren Zeitpunkten, wohingegen innerhalb der übrigen Stadien eine geringere Anzahl signifikanter Unterschiede nachgewiesen wurde. Für die 402 differentiell exprimierten Proteine konnten verschiedene charakteristische Protein-expressionsverläufe nachgewiesen werden, welche Rückschlüsse auf die biologischen Hintergründe ermöglichten. Durch massenspektrometrische Analysen der Proteine mittels MALDI-TOF/TOF und LC-MS/MS gelang es, 203 der 242 zur Identifikation vorgesehenen Spots zu identifizieren. Im Rahmen einer bioinformatischen Auswertung des erhaltenen Datensatzes erbrachten sowohl die genontologische Analysen als auch Pathway-Analysen wesentliche Anhaltspunkte für die Auswahl besonders interessanter und vielversprechender Proteine für weiterführende funktionelle Analysen. Unter den identifizierten, differentiell exprimierten Proteinen fanden sich auffällig viele Vertreter des Aktin-Zytoskelett-Pathways, welcher für die mechanische Stabilisierung von Zellen und deren aktive Bewegungen verantwortlich ist. Dabei fielen in dieser Arbeit sowohl Vinculin als auch Gelsolin durch ihre charakteristischen Expressionsmuster auf. Vinculin zeigte zu Beginn der embryonalen Entwicklung erhöhte Abundanzwerte, welche nach ET18 steil abfielen. Als fokales Adhäsionsprotein stellt es ein Schlüsselprotein in der Regulation der Übertragung von kontraktilen Kräften dar, welche die Voraussetzung für die Migration von Zellen sind. Gelsolin, ein wichtiges Apoptose-Effektorprotein, welches auch in Verbindung mit Zellmotilität gebracht wird, zeigte erhöhte Expressionslevel an ET18, welche über die nachfolgenden Entwicklungszeitpunkte abfielen. Gelsolin konnte in drei verschiedenen Ladungs-Isoformen detektiert werden. Für die Fragestellung dieser Arbeit interessant erschien weiterhin eine Gruppe differentiell exprimierter Proteine des Retinolsäure-Metabolismus. Im Einzelnen wurden die Retinaldehydrogenase 2 (ALDH1A2), das „retinol-binding protein 5“ (RBP5), das „fatty acid-binding protein 7“ (FABP7), und Transthyretin (TTR) mit ähnlichen Proteinexpressions-profilen detektiert, welche ihr Expressionsmaximum jeweils an ET10 aufwiesen. Das könnte ein Hinweis sein, dass die embryonale Entwicklung der Bursa Fabricii von ähnlichen Faktoren gesteuert ist wie die embryonale Ausbildung der sekundär-lymphatischen Organe beim Säuger, bei der Retinolsäure-abhängige Proteine eine entscheidende Rolle spielen. Über die Thematik dieser Arbeit hinausgehend, stellt der umfangreiche proteomische Datensatz dieser Arbeit eine wertvolle Ressource dar, die sowohl für weitere Fragestellungen bezüglich der Bursa Fabricii des Huhns, als auch für die Vervollständigung der Annotation des Hühnergenoms genutzt werden können.

Abstract

The aim of this study was to characterize molecular changes during B-cell development in the chicken Bursa of Fabricius applying proteomic techniques. First, samples were taken at four representative stages of B-cell differentiation, which was embryonic day 10 (ED10), embryonic day 18 (ED18), day 2 and day 28 after hatch and subjected to qualitatitve proteome analysis. Using 1D-SDS-PAGE followed by nano-HPLC for separation, tandem mass spectrometry led to the identification of 1152 to 1392 proteins for each of the four stages and 2214 proteins in total. These included 537 proteins which were found in all samples, containing mostly proteins essential for cell structure and metabolism. In addition, we performed a qualitative proteome analysis of purified bursa-derived B-cells, which led to the identification of 758 proteins. Gene ontology analyses revealed proteins related to cell growth being more prominent at early developmental stages, while immune related proteins were preferentially identified at later stages, hence reflecting bursal development from an immature developing bursa anlage to the fully developed, primary lymphatic organ. Consistent with high proliferation rates of the B-cells during bursal development, many proteins related to cell division were found in the bursal B-cell proteome. Proteins linked to cell migration were primarily found in the B-cell lysate, as well as in bursa lysate from ED 10. This suggests that these proteins may participate in the immigration of B-cells into the bursa anlage. Subsequent quantitative proteome analyses for the same developmental stages were performed using 2D-DIGE on six biological replicates for each stage. Statistical analysis revealed 402 differentially abundant proteins between the bursal proteomes of the four stages, while highly similar results for all biological replicates confirmed the high reproducibility for the differences between all stages. The most significant changes were detected between the bursal proteome of ED10 and the following stages, while all other stages showed fewer but also distinct changes. These protein spots were assigned to several characteristic courses of expression profiles, facilitating correlation to the underlying biological processes. Using MALDI-TOF/TOF analysis, 203 out of 242 prominent spots could be identified. Bioinformatic evaluation of the data set, comprising gene ontology as well as pathway analyses, revealed promising candidate proteins for further functional characterization. Interestingly, a noticably large amount of differentially abundant proteins was associated with the pathway for regulation of the actin cytoskeleton, which is known to be involved in mechanical stabilization of cells and their active movements. In particular vinculin as well as gelsolin were noticed due to their characteristic expression profiles. Vinculin showed high expression levels at early embryonic development, which declined rapidly after ED18. As a focal adhesion protein, vinculin is a key regulator in the transmission of contractile forces, which are required for cell migration. Gelsolin is a known effector protein in apoptosis and is also related to cell motility. It showed increased expression levels on ED18, which gradually declined afterwards. Three differently charged isoforms of Gelsolin could be detected. Another group of highly interesting differentially expressed proteins is linked to retinoic acid metabolism: retinal dehydrogenase 2 (ALDH1A2), retinol-binding protein 5 (RBP5), fatty acid-binding protein 7 (FABP7) and transthyretin (TTR) were detected with similar expression profiles, showing highest levels on ED10. Thus, the embryonic development of the Bursa of Fabricius might be controlled by similar factors as embryonic development of secondary lymphatic tissues in mammals, in which retinoic acid dependent proteins play an important role. In addition to the identification of proteins relevant for this project, the comprehensive data set derived from this extensive study provides a valuable resource, with substantial benefits for future projects regarding the development of the chicken Bursa of Fabricius as well as for the completion of the ongoing chicken genome annotation.