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Bauer, Bettina (2011): Untersuchung der Adaptation des humanpathogenen Schimmelpilzes Aspergillus fumigatus an Stress: Die funktionelle Charakterisierung eines CipC-homologen Proteins. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Vor Beginn dieser Arbeit war ein A. fumigatus-Protein (Chp: CipC homologes Protein) mit unbekannter Funktion und hoher Homologie zum CipC-Protein aus A. nidulans als prominentes hyphenspezifisches Protein identifiziert worden (Schwienbacher, 2005). Weiterhin gab es zu diesem Zeitpunkt Hinweise, dass ein zu CipC homologes Protein in C. neoformans eine wichtige Rolle während der Virulenz spielt (Steen et al., 2003). In dieser Arbeit sollte die biologische Funktion des pilzspezifischen Proteins genauer untersucht werden. Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper gegen Chp, mehrere Reporterstämme sowie eine Deletionsmutante hergestellt. Die erhobenen Daten zeigen, dass Chp als Monomer im Cytosol der Hyphen vorliegt. Dabei zeigte sich eine gleichmäßige Verteilung eines GFP-Fusionsproteins innerhalb der Hyphen; nur die Vakuolen schienen ausgespart. Die Identifikation des Proteins auf der Sporenoberfläche von A. fumigatus (Asif et al., 2006) wurde wiederlegt und die differentielle Expression des Proteins bestätigt. Anders als in A. nidulans (Melin et al., 2002) wirkt das Antibiotikum Concanamycin A auf die Bildung von Chp in A. fumigatus nicht induzierend. Da diese Tatsache sowohl für die Na-mensgebung von CipC, als auch für die Namensgebung von Chp verantwortlich war, sollte das A. fumigatus-Protein umbenannt werden. Die Wahl des Namens fiel auf NrpA (Nitrogen regulated protein A), da die Bildung des Proteins von der N-Quelle abhängig ist. Die N-abhängige Regulation war für ein homologes F. fujikuroi Gen auf RNA-Ebene bereits bekannt (Teichert et al., 2004). In der vorliegenden Arbeit konnte sie in A. fumigatus und erstmals auf Proteinebene bestätigt werden. Desweiteren wurden auch neue N-Quellen untersucht. Dabei zeigte sich, dass NrpA in Anwesenheit der N-Quellen Glutamat, Nitrat oder Harnstoff nicht gebildet wird, wohin-gegen Komplexmedien sowie die N-Quellen Ammonium, Glutamin, Asparaginsäure, Asparagin, Valin und Tryptophan zur Bildung des Proteins führen. In Kombination einer induzierenden und einer unterdrückenden N-Quelle dominiert stets die induzierende. In Reporterstämmen (gfp; lacZ) fand diese negative Regulation der Bildung von NrpA nicht statt. Das Protein wurde sowohl in Anwesenheit einer normalerweise unterdrückenden N-Quelle, als auch in den Sporen gebildet. Weiterhin nimmt die gebildete Menge von NrpA sowohl bei längeren Inkubationszeiten, als auch bei Verwendung höherer Animpfdichten zu. Wird der Pilz zunächst mit einer die NrpA-Bildung unterdrückenden N-Quelle angezogen und dann in Medium mit einer induzierenden N-Quelle umgesetzt, dauert es 6 h bis eine Bildung von NrpA verzeichnet werden kann. Diese Zeitspanne blieb auch in einem inversen Experiment gleich. Als nächstes wurde untersucht, ob NrpA in A. fumigatus unter Stressbedingungen von Bedeutung ist. Dabei konnte gezeigt werden, dass sowohl osmotischer Stress, als auch oxidativer Stress, der durch Menadion verursacht wird, kei-ne Auswirkung auf die gebildete NrpA-Menge hat. Dagegen führt durch H2O2 verursachter Stress zu einem veränderten Laufverhalten von NrpA in SDS-Gelen. Das Protein scheint unter diesen Umständen ein höheres Molekulargewicht zu haben. Mithilfe eines A. fumigatus-Reporterstammes, der ein NrpA-GFP-Fusionsprotein bildet, konnte gezeigt werden, dass H2O2 auch zu einer veränderten Lokalisation von NrpA führt. Das sonst gleichmäßig in den Hyphen verteilte Protein formierte sich in punktförmigen Strukturen. Auch unter Mangelbedingungen spielt NrpA keine wichtige Rolle, denn weder ein C- noch ein N-Mangel verändert die gebildete Menge des Proteins. Dient die normalerweise die NrpA-Bildung induzierende N-Quelle Glutamin als C- und N-Quelle wird NrpA nicht gebildet. Ebenso wie in F. fujikuroi (Teichert et al., 2002) wird die Bildung des NrpA-Proteins durch MSX, einem Inhibitor der Glutaminsynthetase, fast vollständig inhibiert. Anders als in F. fujikuroi (Teichert et al., 2006) verursachte die Inhibierung der TOR-Kinase durch Rapamycin keinen Effekt auf die Bildung von NrpA. Auch durch eine her-gestellte Deletionsmutante konnte die biologische Funktion von NrpA nicht geklärt werden. In zahlreichen vergleichenden Untersuchungen verhielt sich die Mutante ebenso wie der Wildtyp. Der einzige dokumentierte Unterschied zwischen Mutante und Wildtyp ist eine verstärkte Bil-dung der Katalase 1 in der Deletionsmutante. Anders als angenommen spielt NrpA während der Virulenz von A. fumigatus keine Rolle. In einem Virulenzmodell in embryonierten Hühnereiern verhielten sich Deletionsmutante und Wildtyp gleich. Auch in murinen Makrophagen führten die Deletionsmutante und der Wildtyp etwa zu vergleichbaren Mengen an ausgeschüttetem IL-10 und TNFα. Ein potentieller Nutzen von NrpA bei der Diagnose der allergischen bronchoalveolaren Aspergillose (ABPA) konnte ebenso ausgeschlossen werden. Neben NrpA waren im Vergleich der Proteinmuster der verschiedenen A. fumigatus-Morphotypen auch weitere differentiell exprimierte Proteine aufgefallen. Eines davon war eine MnSOD (Aspf6), die bis dahin auch als mitochondriale MnSOD bezeichnet wurde (Rementeria et al., 2007). Da im Genom von A. fumigatus aber eine weitere MnSOD kodiert ist, die über eine putative Mitochondriensignalsequenz verfügt, sollte in einem zweiten Teil der Arbeit die tat-sächliche Lokalisation dieses Proteins gezeigt werden. Dafür wurden zunächst monoklonale Antikörper gegen das Protein hergestellt. Eine mitochondriale Lokalisation der MnSOD mit puta-tiver Signalsequenz konnte gezeigt werden. Dabei wurden sowohl Western-Blots als auch ein A. fumigatus-GFP-Reporterstamm verwendet. Weiterhin konnte das Protein genauer charakteri-siert werden. Im Gegensatz zu Aspf6, das nur in den Hyphen des Pilzes zu finden ist, wurde die mitochondriale MnSOD sowohl in den Sporen, als auch in den Hyphen nachgewiesen. Die gebil-dete Menge des Proteins verändert sich im Zeitverlauf nicht. Lediglich zu sehr späten Wachs-tumszeitpunkten in der späten stationären Phase war ein leichter Anstieg zu beobachten. Die gebildete Menge des Proteins hing auch nicht von der Animpfdichte der Kultur ab. Anders als Aspf6, das bekannterweise ein Homotetramer bildet (Flückiger et al., 2002), scheint die mitochondriale MnSOD als Dimer vorzuliegen. Auch in Antwort auf oxidativen Stress verhielten sich die beiden MnSODs unterschiedlich. Menadion, das innerhalb der Zelle die Bildung von Su-peroxidanionen bewirkt, führte zu einem leichten Anstieg der Proteinmenge der mitochondrialen MnSOD, während Aspf6 unverändert blieb. Als Folge von oxidativem Stress, der durch H2O2 verursacht wird, zeigte Aspf6 eine leichte Verringerung, während die mitochondriale MnSOD schnell abgebaut wird. In einem dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der Atmung während der Auskeimung von A. fumigatus genauer untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Proteinbiosynthese für den Auskeimungsprozess unbedingt notwendig ist. Desweiteren wurde mit Hilfe unterschiedli-cher Methoden eine sehr frühe Aktivierung der Atmungskette während des Auskeimungspro-zesses nachgewiesen. Ebenso konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sauerstoff für das Wachstum von A. fumigatus unbedingt erforderlich ist. Im anaeroben Milieu konnten die Konidien weder anschwellen noch auskeimen. Auch bereits vorhandene Hyphen konnten unter Abwesenheit von Sauerstoff nicht weiterwachsen. Weitere Untersuchungen zeigten, dass A. fu-migatus anders als A. nidulans (Takasaki et al., 2004) nicht über die Fähigkeit verfügt, im Anae-roben durch eine Fermentation von Ammonium zu überleben. In dieser Arbeit wurde ebenso wie in anderen aktuellen Arbeiten (Williger et al., 2008) die Fähigkeit von A. fumigatus, in hypoxischen Umgebungen zu wachsen, nachgewiesen.