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Franke, Julia Margareta (2003): Charakterisierung von reptilienpathogenen Paramyxoviren und Analyse des prokaryotisch exprimierten partiellen Fusionsgens. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Viral agents isolated from 18 snakes (families Colubridae, Viperidae, and Crotalidae) showing respiratory symptoms and neuronal diseases were investigated. Identifying the isolates as paramyxoviruses showing characteristic cytopathic effect, was carried out by electronmicroscopy and RNA-PCR of two partial genes (L and F). After sequencing RNA-PCR amplicons, identical sequences were found for the reptilian paramyxoviruses (RPMV) isolated in the same outbreak from different snake species, suggesting they are not host-specific. Sequence alignment of partial L and F genes within the RPMV group revealed sequence homology of at least 79 % for nucleotides (nt), and 94 % for amino acids (aa). Further sequence alignment included the Fer-de-Lance virus (FDLV) as a RPMV representative, the established type species of the paramyxovirus family. The greatest similarity was found to the partial L gene of Sendai virus, with 56 % nt and 61% aa identity. Consequently, the RPMV form a closely related, if somewhat diverse, group, belonging to the family Paramyxoviridae. This result was confirmed by phylogenetic analysis. The RPMV group formed three clusters for the L gene sequence and corresponding clusters for the F gene sequence, leaving the Sendai virus as an outgroup, which was included as a representative of the paramyxovirus family. Another phylogenetic analysis based on partial L and F protein sequences included the FDLV and the established paramyxovirus type species. In this case, the FDLV showed the closest relationship to the Sendai virus. The fusion (F) gene and protein of the reptilian paramyxovirus isolated from the snake Gonosoma oxycephala were also investigated. The sequences of the 1638 nt F gene and its 546 aa F protein were obtained and these sequences were compared to the F protein of the established paramyxovirus type species. The F protein, like its counterparts, was predicted to be glycosylated and to contain a furin cleavage site in the F1 und F2 subunit. Domains were predicted to be the signal-peptide (SP), a hydrophobic fusion peptide, two heptad repeats (HR A and HR B), a leucine zipper motif, and a transmembrane anchor (TM). To further characterize the F protein and identify antigenic determinants, an E. coli expression system and four plasmids containing four various constructs of the F gene were used: the first contained an insert with the entire gene; the second, an insert with the F gene minus the SP and TM; a third construct was inserted with the F2 subunit minus the SP; and the fourth contained an insert with the F1 subunit minus HR B and TM. To monitor expression, an anti-His tag monoclonal antibody in a Western blot (WB) was used. Antigenic epitopes were identified in WB by the use of polyclonal rabbit antiserum, raised against our isolate. No expression was detected for the first construct containing the entire F gene, but all other constructs produced proteins of the predicted molecular weights. The anti-viral rabbit serum detected only the protein encoded by the second construct, that included the predicted furin cleavage site. After treatment of this recombinant protein with furin, the antiserum reacted with only one of the fragments. The reactive fragment was identical to the fourth recombinant protein except for the inclusion of an additional 30 amino acids that contained HR B. The results indicate that HR B of the reptilian paramyxovirus F protein contains a linear antigenic epitope.

Abstract

Die untersuchten 18 Virusisolate stammten aus Schlangen der Familien Colubridae, Viperidae und Crotalidae, die an Lungensymptomatik und zentralnervösen Störungen erkrankt und teilweise verendet waren. Die Erreger wurden anhand ihres cytopathogenen Effektes, mittels Elektronenmikroskopie und RNA-PCR zweier verschiedener partieller Gene als Paramyxoviren identifiziert. Die Sequenzanalyse der RNA-PCR Amplifikate bewies anhand identischer Isolate aus gleichen Infektionsherden, aber verschiedenen Schlangenspezies, dass die hier untersuchten Reptilien Paramyxoviren (RPMV) nicht streng wirtsspezifisch waren. Sequenzvergleiche partieller L und F Gene zeigten für die RPMV untereinander eine Homologie von mindestens 79 % auf nt-Ebene und 94 % auf as-Ebene auf. Das Ermitteln prozentualer Sequenzunterschiede des Fer-de-Lance Virus (FDLV) und der etablierten Paramyxovirus Typspezies resultierte in einer maximalen Homologie von 56 % auf nt-Ebene und von 61 % auf as-Ebene mit dem Sendai Virus, bezogen auf das partielle L Gen. In phylogenetischen Analysen konnten diese Ergebnisse bestätigt werden. Die RPMV bildeten drei Gruppen für die L Gen Sequenzen und entsprechende Gruppen für die F Gen Sequenzen und grenzten sich deutlich vom Sendai Virus ab. Das Fusions (F) Gen, 1638 Nukleotide (nt), eines der RPMV Isolate wurde sequenziert und in das 546 Aminosäuren (as) F Protein übersetzt. Wie von den etablierten Paramyxovirus Typspezies bekannt, konnte das Protein in die F1 und die F2 Untereinheit gegliedert werden und folgende Protein-Motive als Modell dargestellt werden: das Signalpeptid (SP), ein Furin Schnittmotiv, das hydrophobe Fusionspeptid, zwei Heptad Repeat Motive (HR A und B), ein Leuzin Zipper Motiv und ein Transmembrananker (TM). Zwei N-glycosylierte Reste wurden ermittelt. Das F Gen wurde prokaryotisch exprimiert. Hierfür wurden vier verschiedene Plasmide konstruiert: eines beinhaltete das gesamte F Gen, das zweite das gesamte Gen ohne das SP und ohne den TM. Ein drittes beinhaltete die F2 Untereinheit ohne das SP und ein viertes die F2 Untereinheit ohne das HR B und den TM. Die prokaryotische Expression des gesamten RPMV F Gens war nicht erfolgreich. Es konnten aber rekombinante Proteine der vorherbestimmten Molekulargewichte für alle anderen Plasmidkonstruktionen erhalten werden. Mittels eines Anti-RPMV Kaninchenserums konnte ausschliesslich das zweite rekombinante Protein im WB detektiert werden, das auch das Furin Schnittmotiv enthielt. Nach Verdau dieses Proteins mit der Endopeptidase Furin detektierte das Antiserum noch ein Protein, das mit dem vierten rekombinanten Protein bis auf das HR B identisch ist. Das HR B ist eine 30 as lange Domäne, die zugleich das Leuzin Zipper Motiv darstellt und den Untersuchungen zufolge ein lineares antigenetisches Epitop beinhaltet.