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Sitz, Jan Hendrik (2003): Zur Funktion der Kinase Dyrk1A im Gehirn der adulten Maus. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

The Drosophila gene minibrain codes for a protein kinase. Mutants with a reduced expression of minibrain are characterised by a strongly reduced brain size and learning and memory deficits. Dyrk1A is the mammalian homologue of minibrain; the encoded protein is the founding member of the family of Dyrk protein kinases. The human DYRK1A gene is implicated in the emergence of the cognitive deficits in Down syndrome, due to its location on chromosome 21 in the so-called Down syndrome critical region (DSCR), its overexpression in Down syndrome individuals and also because Dyrk1A-overexpressing mice show learning and memory deficits. Taken together, these data point to a gene dosage dependent function of Dyrk1A/minibrain in processes that are associated with cognitive functions such as learning and memory. The aim of this study was to elucidate the function of Dyrk1A in the adult mammalian brain. Three aproaches were chosen: First, an analysis of the expression of Dyrk1A and of the intracellular localisation of the respective protein in the adult mouse brain was performed. Dyrk1A is expressed in several brain areas, e.g. in the neocortex, in the hippocampal formation and in the cerebellum. In neurons, Dyrk1A is located either mostly nuclear, or predominantly or even exclusively in the cytoplasm, depending on the region and on the type of neuron. Second, to characterise the gene dosis dependent function of Dyrk1A, it was intended to generate transgenic mice that express a third copy of Dyrk1A, as it is the case in human trisomy 21 (Down syndrome). These transgenic mice should express the third copy of Dyrk1A in a region- and time-specific manner, e.g. in principal neurons in the adult forebrain. This should avoid developmental defects and disturbances of, e.g., the motor system and should allow for the specific analysis of the role of Dyrk1A in learning and memory and in brain regions involved in cognitive processes. A BAC (bacterial artificial chromosome) clone containing the whole Dyrk1A locus was isolated. This BAC was modified by homologous recombination in E. coli (GET recombination) to render it suitable for the generation of transgenic mice. Furthermore, a recombination cassette for a second modification step was constructed to allow for the region- and time-specific expression of the Dyrk1A gene on the BAC. Third, a yeast two-hybrid screen to identify proteins interacting with Dyrk1A was performed. Two of six clones obtained were shown to code for proteins interacting specifically with Dyrk1A: Sept4 (Pnutl2/H5/CDCrel-2), a GTPase of the Septin family, and Arip4, a steroid hormone receptor cofactor with ATP-dependent chromatin-remodelling activity. These interactions were confirmed in mammalian cells by coimmunoprecipitation. By in situ-hybridisation, the coexpression of Dyrk1A with the genes of both interactors was shown in various brain regions. In addition, Dyrk1A and Arip4 were shown to be colocalised in a speckle-like nuclear subcompartment in primary rat hippocampal neurons and in mammalian cell lines. These results point to an interaction of Dyrk1A with Arip4 also in vivo and implicate Dyrk1A in steroid hormone-mediated signalling. Furthermore, an interaction between Dyrk1A and Sept5/CDCrel-1, a close relative of Sept4, was shown. Sept5 is thought to play an inhibitory role in the fusion of synaptic vesicles with the presynaptic membrane and transmitter release. The results of this study contribute to the understanding of the role of Dyrk1A in physiological and pathophysiological contexts. Eventually, this should help (i) to elucidate the mechanisms that lead to mental retardation in Down syndrome and (ii) to develop tools to interfere with the function of Dyrk1A and to establish novel strategies for a therapy to alleviate mental retardation in Down syndrome.

Abstract

Das minibrain-Gen der Taufliege Drosophila melanogaster kodiert für eine Proteinkinase (mnb) mit bislang nicht eindeutig geklärter Funktion. Mutanten mit einer reduzierten minibrain-Expression weisen neben einer deutlich verringerten Gehirngröße unter anderem Defizite im Lernverhalten auf. Dyrk1A ist das Säuger-Homologe des minibrain-Gens; das entsprechende Protein ist das prototypische Mitglied der Dyrk-Proteinkinasen. Das humane Dyrk1A-Gen gilt aus mehreren Gründen als zumindest mitverantwortlich für die kognitiven Defizite, die mit dem Down-Syndrom einhergehen: wegen seiner chromosomalen Lokalisation in der sogenannten Down Syndrome Critical Region auf Chromosom 21, wegen seiner Überexpression in Down-Syndrom-Individuen und aufgrund von Lern- und Gedächtnisdefiziten Dyrk1A-überexprimierender Mäuse. Diese und die an den Drosophila-Mutanten erhobenen Befunde deuten auf eine gendosisabhängige Funktion von Dyrk1A/minibrain im Zusammenhang mit kognitiven Leistungen wie Lernen und Gedächtnis hin. Gegenstand dieser Arbeit war die Analyse der Funktion von Dyrk1A im Gehirn adulter Säuger. Hierzu wurden drei Ansätze gewählt: Erstens wurde eine Analyse der Expression von Dyrk1A im Gehirn der Maus sowie eine Untersuchung der intrazellulären Lokalisation des entsprechenden Proteins durchgeführt. Dyrk1A ist in einer Reihe von Gehirnarealen exprimiert, unter anderem im Neocortex, in der Hippocampusformation und im Cerebellum. Innerhalb von Neuronen ist Dyrk1A – je nach Region und Zelltyp – teils überwiegend nukleär, teils auch oder ausschließlich zytoplasmatisch lokalisiert. Zweitens sollten – um die gendosisabhängige Funktion von Dyrk1A zu charakterisieren – transgene Mäuse hergestellt werden, die eine dritte Kopie des Dyrk1A-Gens exprimieren, wie dies auch bei der humanen Trisomie 21, dem Down-Syndrom, der Fall ist. Die transgenen Mäuse sollten diese dritte Kopie des Dyrk1A-Gens allerdings orts- und zeitspezifisch aktivierbar – beispielsweise in Prinzipalneuronen des Vorderhirns – exprimieren. Dies sollte unerwünschte Einflüsse auf den Phänotyp durch Entwicklungsdefekte und Beeinflussung anderer neuronaler Systeme ausschließen und gestatten, die Rolle von Dyrk1A in Gehirnregionen, die für Lernen und Gedächtnis verantwortlich sind, spezifisch zu untersuchen. Hierfür wurde ein BAC (bacterial artificial chromosome) isoliert und charakterisiert, das den gesamten Dyrk1A-Locus der Maus als Insertion trägt. Dieses BAC wurde mittels homologer Rekombination in E. coli (GET-Rekombination) gezielt modifiziert, um es zur Herstellung von transgenen Mäusen verwenden zu können. Weiterhin wurde eine Rekombinationskassette für einen zweiten Modifikationsschritt konstruiert, um die oben beschriebene orts- und zeitspezifische Expression des Gens zu ermöglichen. Drittens wurden zur weiteren Charakterisierung der Funktion der Proteinkinase Dyrk1A mit dem Yeast two-hybrid-Verfahren Dyrk1A-interagierende Proteine identifiziert. Zwei der erhaltenen Klone wurden als spezifisch mit Dyrk1A interagierende Proteine bestätigt: Sept4, eine GTPase der Septin-Familie, und Arip4, ein Chromatin-modellierender Steroidhormon-Rezeptor-Kofaktor mit ATPase-Aktivität. Die Interaktionen wurden in Säuger-Zellen durch Koimmunpräzipitation bestätigt. Mittels in situ-Hybridisierung konnte eine Koexpression von Dyrk1A mit den Genen beider Interaktoren in verschiedenen Gehirnregionen nachgewiesen werden. In neuronalen Primärkulturen und Säuger-Zellinien wurde eine Kolokalisation von Dyrk1A und Arip4 in nukleären Strukturen gefunden. So konnte hier Arip4 als ein neues in vitro und höchstwahrscheinlich auch in vivo mit Dyrk1A interagierendes Protein identifiziert werden. Damit weist diese Arbeit auf eine mögliche Rolle von Dyrk1A in der Steroidhormon-Rezeptor-vermittelten Signaltransduktion hin. Weiterhin wurde die Interaktion von Dyrk1A mit Sept5 gezeigt, einem nahen Verwandten von Sept4 mit einer wahrscheinlichen inhibitorischen Rolle in der Fusion von synaptischen Vesikeln und der Transmitterfreisetzung. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern einen Beitrag zum Verständnis der Rolle von Dyrk1A im physiologischen und pathophysiologischen Kontext. Dies sollte letztendlich dazu beitragen, eine Strategie zur Beeinflussung der Funktion von Dyrk1A und damit eventuell zur Therapie der mentalen Retardierung im Rahmen des Down-Syndroms zu entwickeln.