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Zhou, Rui (2003): Functional analysis of insulin-like growth factor binding protein -4 and -6 in transgenic mice. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Insulin-like growth factors (IGF-I and IGF-II) are expressed in many cell types and tissues and act in endocrine, autocrine or paracrine manner to regulate cellular proliferation, survival and differentiation. IGF actions are initiated upon binding to the type I IGF receptor (IGF-IR) and are modulated through interactions with a family of six secreted IGF-binding proteins (IGFBP-1 to -6). Although the six conserved IGFBPs are structurally related, each of them has specific characteristics and may have specific functions. Most knowledge about the IGFBPs has been gained from the numerous in vitro studies, their specific roles in vivo are largely unknown. Transgenic mice overexpressing a particular IGFBP allow us to investigate the specific functions of the corresponding IGFBP in vivo. To this end, IGFBP-4- and IGFBP-6-overexpressing models were established and analyzed in the present study. First, an expression vector containing the murine H-2Kb promoter and a human beta-globin splicing cassette was used to construct the transgenes, to obtain ubiquitous expression of the mouse Igfbp4 and Igfbp6 cDNA. Two lines of H-2Kb-mcIGFBP-4 and ten lines of H-2Kb-mcIGFBP-6 transgenic mice were generated. The transgene was ubiquitously expressed at RNA level in both transgenic models, however, at protein level, transgene expression was only detected in the spleen, thymus, lung and kidney of both H-2Kb-mcIGFBP-4 transgenic lines, but in no organ of H-2Kb-mcIGFBP-6 transgenic mice. Phenotypic analyses of the H-2Kb-mcIGFBP-4 transgenic model revealed that overexpression of IGFBP-4 had no significant effect on the postnatal body and organ growth, except that the weight and volume of thymus in 8- and 12-week-old transgenic mice were significantly reduced (p < 0.05) compared to the controls. Histomorphometric analysis demonstrated that the volume of the thymic cortex was significantly decreased in transgenic mice (p < 0.05), whereas that of the thymic medulla was not changed. The fractions of various cell types in the bone marrow, thymus, spleen, lymph node and peripheral blood were determined by flow cytometry. No significant difference was found between transgenic and control groups, suggesting that IGFBP-4 excess in the lymphoid organs did not affect the development of the lymphatic cells. The proliferative capacity of the splenocytes of transgenic animals was significantly reduced after Con A and LPS stimulation (p < 0.05), but not altered after the stimulation by anti-CD3 and anti-IgM/IL2. This is probably due to transgenic IGFBP-4 expression restricted in the non-lymphatic cells. However, detailed expression of the transgene warrants further investigation. In order to realize IGFBP-6-overexpressing mice, a second construct was designed, namely CMV-mgIGFBP-6, in which the mouse Igfbp6 genomic sequence was cloned under the control of the cytomegalovirus (CMV) promoter. Four independent lines of transgenic mice were generated. Transgene expression was high in the exocrine pancreas and relatively low in the lung and liver. The activities of serum IGFBPs were not different between transgenic mice and controls. In transgenic mice, high levels of active IGFBP-6 were detected in the luminal content of the duodenum, but neither in the luminal contents of other segments of the gastrointestinal tract (GIT), nor in tissue extracts of all GIT segments. Glucose homeostasis was not altered by IGFBP-6 expression. Postnatal body and organ growth was not affected in transgenic mice, except for the absolute and relative weight and length of duodenum which were significantly reduced in 4-month-old transgenic mice as compared to controls (p < 0.05). This reduction was mainly due to a significantly smaller volume and surface area of the tunica mucosa as determined by histomorphometric analsis. Our analysis of the first IGFBP-6 transgenic mouse model provides direct evidence for inhibition of intestinal growth by luminal IGFBP-6 excess. This finding is important in the context of neonatal intestinal growth of mammals, considering the fact that milk contains large amount of IGFBPs which may at least in part arrive intact in the intestine.

Abstract

Die insulinänlichen Wachstumsfaktoren (IGF-I und IGF-II) werden in verschiedenen Zelltypen und Geweben exprimiert, und regulieren Zellproliferation, -überleben und -differenzierung durch endokrine, autokrine oder parakrine Mechanismen. Die Aktivitäten der IGFs werden durch den Typ 1 IGF-Rezeptor (IGF-IR) initiiert und durch die Interaktionen mit einer Familie von sechs IGF-Bindungsproteinen (IGFBP-1 bis -6) moduliert. Trotz ihrer strukturellen Ähnlichkeiten zeigt jedes IGFBP spezifische Eigenschaften und spielt eine spezifische Rolle. Weil die meisten Kenntnisse über die IGFBPs durch in vitro Studien gewonnen wurden, sind ihre spezifischen Funktionen in vivo weitgehend unklar. Transgene Mäuse, in denen ein bestimmtes IGFBP überexprimiert ist, eignen sich zur funktionellen Analyse des entsprechenden IGFBP in vivo bedienen. Deshalb wurden IGFBP-4 und IGFBP-6 transgene Mausmodelle erstellt und analysiert. Um eine ubiquitäre Expression der cDNA von Igfbp4 oder Igfbp6 zu erzielen, wurde ein Expressionsvektor, der den murinen H-2Kb Promotor und eine humane beta-globin Spleißkassette enthält, zuerst zum Aufbau transgener Konstrukte verwendet. Zwei Linien H-2Kb-mcIGFBP-4- und zehn Linien H-2Kb-mcIGFBP-6-transgener Mäuse wurden erstellt. Ubiquitäre transgene Expression wurde auf RNA-Ebene bei beiden transgenen Modellen erreicht. Erhöhte IGFBP-4 Proteinmengen konnten nur in Milz, Thymus, Lunge und Niere H-2Kb-mcIGFBP-4-transgener Tiere nachgewiesen werden, aber nicht bei den H-2Kb-mcIGFBP-6-transgenen Mäusen. Eine phänotypische Analyse des H-2Kb-mcIGFBP-4-transgenen Modells zeigte keinen Effekt der IGFBP-4-Überexpression auf das postnatale Körper- und Organwachstum, bis auf das Gewicht und Volumen des Thymus, das bei 8- und 12-Wochen alten transgenen Mäusen deutlich reduziert war (p < 0,05). Histomorphometrische Untersuchungen zeigten, dass das Volumen des Cortexes, aber nicht der Medulla, verkleinert ist. Die Fraktionen verschiedener Zelltypen aus dem Knochenmark, dem Thymus, der Milz, dem Lymphknoten und dem peripheren Blut wurden mittels der Flowcytometrie untersucht. Es konnte kein Unterschied zwischen den IGFBP-4-transgenen und Wildtyp-Tieren gezeigt werden. Dieses Ergebnis gibt keinen Hinweis, dass die IGFBP-4-Überexpression eine Wirkung auf die Entwicklung der Lymphozyten hat. Nach der Con A- und LPS-Stimulation wurde die Proliferationskapazität der Milzzellen deutlich verringert, dagegen zeigte sich kein Unterschied zwischen den transgenen und Wildtyp-Mäusen bei der Proliferationskapazität nach der Stimulation mit anti-CD3 und anti-IgM/IL-2. Solche Phänotypen konnten infolge davon sein, dass das Transgen hauptsätzlich in den Nicht-Lymphozyten exprimiert wird. Jedoch muss das genaue Expressionsmuster des Transgens in den Lymphorgane weiter studiert werden. Um die IGFBP-6-Überexpression in vivo zu erreichen, wurde ein zweites Transgenkonstrukt (CMV-mgIGFBP-6) kloniert, in dem eine genomische Sequenz des murinen Igfbp6-Gens unter der Transkriptionskontrolle des Cytomegalovirus (CMV)-Promotors steht. Vier unabhängige transgene Mauslinien wurden erstellt. Die Transgenexpression war sehr hoch im exokrinen Pankreas und relativ niedrig in Lunge und Leber der transgenen Tiere. Die Menge aller IGFBPs im Serum verändertete sich nicht. Interessanterweise wurde eine erhöhte Proteinmenge des aktiven IGFBP-6 im Lumeninhalt des transgenen Duodenums nachgewiesen, aber konnte nicht in den Lumeninhalten anderer Segmente des Magen-Darm-Traktes und auch nicht in den Gewebextrakten aller Segmente des Magen-Darm-Traktes nachgewiesen werden. Hinsichtlich der Glukosehomöostase und des postnatalen Körper- und Organwachstums konnte kein Unterschied zwischen den transgenen und wildtypen Tieren gezeigt werden. Eine Ausnahme waren das Gewicht und die Länge (absolute und auch relative Werte) des Duodenums 4-Monate-alten-transgener Mäuse, die im Vergleich zu Wildtyp-Tieren deutlich reduziert waren (p < 0,05). Morphometrische Untersuchungen zeigten, dass diese Reduzierung die Folge von einer Verkleinerung von Volumen und Oberfläche der Duodenummukosa war. Die Analyse des ersten IGFBP-6-transgenen Mausmodels hat einen direkten Hinweis gegeben, dass erhohte IGFBP-6-Aktivität im Lumen des Darmes das Darmwachstum verhindern kann. Diese Entdeckung ist wichtig im Kontext vom Darmwachtum bei der neonatalen Säugertieren, unter Berücksichtigung der Tatsache, dass die Milch eine grosse Menge von IGFBPs enthält, welche zumindest teilweise intakt den Darm erreichen können.