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Ahting, Uwe (2001): Der TOM-Core-Komplex und die kanalbildende Komponente Tom40 der Proteintranslokase der äußeren Mitochondrienmembran von Neurospora crassa. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Die Biogenese von Mitochondrien erfordert den Eintransport cytosolisch synthetisierter Vorstufenproteine über die mitochondriale Außenmembran. Der TOM-Komplex in der Außenmembran erkennt die in die Mitochondrien zu importierenden Vorstufenproteine, bindet sie, ermöglicht den Transfer von zumindest Teilen davon über die mitochondriale Außenmembran und die Integration von Membranproteinen in die Außenmembran. Auf der Grundlage bestehender Untersuchungen des TOM-Holo-Komplexes wurden in dieser Arbeit verschiedene Subkomplexe des TOM-Komplexes aus Neurospora crassa isoliert, biochemisch und biophysikalisch charakterisiert. Zudem wurde eine neue Komponente des TOM-Komplexes identifiziert: Tom5, eine kleine Komponente von etwa 5 kDa mit Sequenzhomologie zu Tom5 von Saccharomces cerevisiae. Der in dieser Arbeit isolierte TOM-Core-Komplex besteht aus den Protein-untereinheiten Tom40, Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5; gegenüber dem TOM-Holo-Komplex fehlen ihm die Rezeptorkomponenten Tom70 und Tom20. Der TOM-Core-Komplex weist eine Molekülmasse von ca. 400 kDa und eine Stöchimetrie der Komponenten Tom40 : Tom22 : Tom7 : Tom6 von 8 : 4 : 2 : 1-2 auf. Er kann in vitro präsequenzabhängig bis zu 8 Vorstufen-proteine pro Komplex binden. Elektronenmikroskopische Bilder des TOM-Core- Komplexes zeigen eine symmetrische Doppelringstruktur mit zwei durchgehenden Poren von etwa 2,1 nm Durchmesser. Der TOM-Core-Komplex bildet in Übereinstimmung damit Kanäle mit zwei Leitfähigkeits-niveaus, die zwei Poren entsprechen. Die Bevorzugung von Kationen und die Eigenschaft, durch mitochondriale, positiv geladene Präpeptide selektiv und spezifisch inhibiert zu werden, belegen die Rolle des TOM-Core-Komplexes bei der Proteintranslokation. TOM-Core-Komplex, dessen hydrophile Domänen von Tom22 und den kleinen Toms durch limitierte Proteolyse weitgehend abgedaut wurden, zeigte in den durchgeführten Untersuchungen nahezu identische Binde-, Kanal- und Struktureigenschaften wie der unbehandelte Core-Komplex. Die Grundstruktur der Proteintranslokase der mitochondrialen Außenmembran Zusammenfassung - 132 - kann somit hinreichend durch Tom40 und die membrandurchspannenden Domänen von Tom22, Tom7, Tom6 und Tom5 stabil gebildet werden. Weiterführende Experimente mit isoliertem Tom40 bestätigten dies. So bildet isoliertes Tom40 oligomere Strukturen mit einer mittleren Molekülmasse von ca. 350 kDa. Tom40 zeigte sich in Transmissions-EM-Bildern überwiegend als Einlochpartikel. In Übereinstimmung hiermit weisen die vom Tom40- Komplex gebildeten Kanäle eine Leitfähigkeit von nur der Hälfte der Leitfähigkeit des TOM-Core-Komplexes mit zwei Poren auf. Ein kleiner Teil des isolierten Tom40 bildet Zweilochpartikel. Tom40 ist also in der Lage, die Grundstruktur des TOM-Komplexes zu bilden, wie sie für den TOM-Core-Komplex gefunden wurde. Infrarot- und Circulardichroismus-Spektren von isoliertem Tom40 führen zu dem Schluß, daß ein einzelnes Tom40-Protomer keinen Kanal mit β -Barrel-Struktur bilden kann, sondern daß dazu mehrere Tom40 zusammenwirken müssen.