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Hofmaier, Florian (2010): Equine rezidivierende Uveitis: Pathogenese assoziierte Faktoren im Glaskörper. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Die equine rezidivierende Uveitis (ERU) ist eine häufige (10%), spontane, immun-mediierte, wiederkehrende Entzündung des inneren Pferdeauges, die letztendlich zur Erblindung des betroffenen Auges führt. Neben ihrer Bedeutung für die Veterinärmedizin stellt die ERU das einzige spontane Tiermodell für die autoimmun-mediierte Uveitis des Menschen dar, so dass Fortschritte in der Erforschung der ERU auch einen Beitrag für ein besseres Verständnis dieser Erkrankung beim Menschen leisten. Die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen am Zielorgan, die zur Entstehung der ERU und den rezidivierenden Entzündungsschüben führen, sind bis heute nicht geklärt. Durch seinen unmittelbaren Kontakt zur Retina ermöglicht der Glaskörper einen indirekten Einblick auf die in der Retina ablaufenden pathophysiologischen Prozesse und stellt ein wertvolles Probenmaterial bei der Erforschung vitreoretinaler Erkrankungen wie der ERU dar. Ziel dieser Arbeit war es, Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Insgesamt wurden in dieser Arbeit 119 Glaskörperproteine mittels LC-MS/MS identifiziert. Hiervon konnte durch eine Label-free Quantifizierung für 79 Proteine eine differenzielle Expression nachgewiesen werden. 17 Proteine zeigten eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben von an ERU erkrankten Pferden, wohingegen 62 Proteine in ihrer Expression vermindert waren. Durch die mit der Software STRING (Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins) durchgeführte Protein-Interaktionsnetzwerk-Analyse konnten vier Cluster von Proteinen identifiziert werden, die bei der ERU verändert exprimiert werden. Neben einer Gruppe von Plasmaproteinen, einer aus Zelladhäsions-Proteinen bestehenden Gruppe und Proteinen des Wnt-Signalweges wurde erstmalig eine funktionell mit den Matrix-Metalloproteinasen MMP-2 und MMP-9 assoziierte Gruppe identifiziert, für deren Vertreter ebenfalls eine differenzielle Expression in der Pferderetina nachgewiesen wurde. Der Wnt-Inhibitor SFRP-2 war in den Glaskörpern von an ERU erkrankten Pferden vermindert nachweisbar und zeigte eine Assoziation mit der Expression seines Interaktors Wnt3a in der gesunden Pferderetina. Mit A2M konnte durch SF-TAP Aufreinigung ein bislang unbekannter Interaktor für SFRP-2 identifiziert und in Bezug zur ERU weiter charakterisiert werden. Für das Protein Osteopontin konnte eine signifikant erhöhte Expression in den Glaskörperproben und Retinae der Kontrollpferde nachgewiesen werden. Rückblickend erwies sich die Protein-Netzwerkanalyse der durch LC-MS/MS identifizierten, differenziell exprimierten Proteine als geeignete Methode, um Pathogenese assoziierte Glaskörperproteine und deren funktionelle Interaktionsnetzwerke in der ERU zu identifizieren und zu analysieren. Weitere Experimente sind nun notwendig, um die funktionelle Bedeutung der neu identifizierten Proteine und der mit ihnen assoziierten Signalwege in der ERU zu evaluieren.

Abstract

Equine recurrent uveitis (ERU) is a devastating immune mediated inflammation targeting the inner eye, ultimately leading to blindness in the affected animals. The widespread disease (10%) is characterized by recurring episodes of inflammation interrupted by quiescent stages. The underlying mechanisms triggering the onset of the disease as well as the precise factors involved in the recurring episodes have yet to be identified. Besides its impact on veterinary medicine, ERU represents the only spontaneous animal model for human autoimmune uveitis. Therefore, knowledge gained by studying the pathogenesis of ERU does contribute to a better understanding of the factors involved in human disease. Since the vitreous is directly adjacent to the retina, this compartment facilitates the indirect exploration of ongoing disease related events in the retina. Therefore the vitreous has proven to be a very valuable sample when studying vitreoretinal diseases like ERU. The aim of this study was the identification and quantification of differentially expressed proteins in the vitreous of horses suffering from ERU in comparison to unaffected control animals, enabling the identification of ERU-related functional protein-networks and affiliated molecular signalling pathways through protein network analysis. This task was accomplished using LC-MS/MS based label-free quantification followed by protein-network analysis with the Search Tool for Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING). A total of 119 vitreous proteins were identified of which 17 were found to be upregulated during ERU and 62 showed a decreased expression in samples derived from diseased animals. The protein-network analysis led to the identification of four functional protein clusters, in which changes in protein expression occurred in ERU. Apart from a group of plasma derived proteins, a group of proteins related to cell adhesion as well as proteins from the Wnt-signaling pathway, a yet undescribed pathway for ERU involving the Matrix-Metalloproteinases MMP-2 and MMP-9 and their specific inhibitor TIMP-2 stood out. For the proteins associated with the latter cluster, a differential expression was also shown in the target tissue of ERU, the retina. A decreased expression of the canonical Wnt-signalling inhibitor, SFRP-2, was also detected in ERU vitreous. SFRP-2 expression was successfully linked to the expression of its interactor Wnt3a in the healthy retina. Furthermore, a yet unknown interactor for SFRP-2, A2M, was identified using SF-TAP pull-down and was successfully validated by confirming co-expression and differential regulation of both proteins in equine retina. Surprisingly, a described enhancer of inflammation in uveitis, Osteopontin, was only detected in healthy vitreous and retina. In conclusion, LC-MS/MS followed by protein-network analysis has proven to be a suitable tool for analyzing differentially expressed proteins and their associated pathways in the vitreous of horses suffering from ERU. Further experiments are needed to evaluate the functional impact of the newly discovered proteins and their associated pathways on ERU pathogenesis.