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Koelle, Nina (2003): Assistierte Reproduktion beim Pferd: Eine Literaturstudie. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

In the mare, the practical use of assisted reproduction techniques has been very limited so far. Embryo transfer is used only in a few countries to a low extent. The main reason for this situation is that there is no practical method available for superovulation in the mare. The majority of equine embryos are therefore collected from spontaneously ovulating mares. Synchronisation of the oestrous cycle of the donor and recipient mare before transfer is of major importance. In synchronized recipients, ovulation should occur one day before to three days after the donor mare's ovulation. Ovariectomized, hormone-treated mares have also been used as embryo recipients. In young, fertile mares embryo recovery rates up to 90 % have been reported. Embryo recovery rates for older, infertile mares are only between 20 to 40 %. Embryo recovery is generally performed nonsurgically by transvaginal flushing of the uterus. Nonsurgical recovery of embryos is not possible before day 6 post ovulation. Equine embryos are transferred by surgical flank incision or by nonsurgical, transvaginal transfer. Surgical transfer is mainly used in commercial embryo transfer programs with pregnancy rates up to 80%. The advantage of nonsurgical transfer is the noninvasive technique and the low costs, but results vary tremendously. Cooled, transported embryos offer great advantages in the management of transfer programs. Cooling for 24 to 30 hours does not seem to impair the viability of embryos. Conventional methods of cryopreservation or vitrification can be used for long term storage of equine embryos. Smaller embryos withstand cryopreservation better than large embryos. Micromanipulation of equine embryos can be used to produce monozygotic twins and for embryo sexing. The efficiency of embryo production by extracorporal fertilization in the horse is very low so far. Equine oocytes can be recovered by one of four methods: surgically, by transcutaneous flank puncture, by transvaginal aspiration or by aspirating, scraping or rupturing follicles of slaughterhouse ovaries. Different culture media can be used for in vitro oocyte maturation. After 30 hours of incubation in TCM 199, the maturation rate of equine oocytes to metaphase II is up to 80 % . In vivo fertilization of oocytes can be achieved by surgical transfer into the oviduct or follicles of inseminated recipient mares. The procedure of gamete intrafallopian tube transfer (GIFT) involves transfer of oocytes and spermatozoa into the oviduct of a recipient mare. Since only low sperm numbers are required, GIFT can be used for subfertile stallions, frozen-thawed semen and sexed spermatozoa. Conventional methods or vitrification can be applied for the cryopreservation of equine oocytes. Maturation rates in vitro are lower for frozen-thawed than for fresh oocytes but results of in vitro fertilization rates are comparable. In contrast, embryonic development rates of frozen-thawed oocytes seem to be affected by cryopreservation. In vitro fertilization of matured oocytes can be performed by co-incubation of oocytes and spermatozoa or by assisted fertilization techniques such as mechanical manipulation of the zona pellucida, zona drilling or intracytoplasmic sperm injection (ICSI). Fertilization rates with conventional methods are low (0-25 %), whereas fertilization rates up to 52% are reported with ICSI. Viable offspring has been produced with both techniques. Fertilized oocytes can be cultured to the stage of morula or blastocyst in vivo or in vitro. Co-culture with somatic cells seems to be important for embryonic development in vitro. Live foals have already been produced using in vitro cultured embryos, which developed from ICSI of in vitro matured oocytes.

Abstract

Bei der Stute ist die praktische Anwendung von Biotechniken in der Reproduktion bisher sehr begrenzt. Der Embryotransfer wird nur in einigen Ländern in geringem Umfang durchgeführt. Eine wesentliche Ursache hierfür ist, dass die klassische Indikation für den Embryotransfer, die Multiplikation des Genpotentials bestimmter Stuten, beim Pferd aufgrund der fehlenden Möglichkeit zur Auslösung von Superovulationen nicht im Vordergrund steht. Aus diesem Grund werden die meisten Stuten während eines Embryotransferprogrammes derzeit nicht stimuliert und die Versuche beschränken sich auf die Gewinnung von Embryonen aus spontanen Ovulationen. Vor der Übertragung eines Embryos ist es notwendig, den Zyklus von Spender- und Empfängerstute zu synchronisieren. Als zyklussynchron werden Empfängerstuten bezeichnet, die in einem Zeitraum von einem Tag vor bis drei Tage nach der Spenderstute ovulieren. Auch hormonbehandelte, ovariektomierte und mit Progestagenen behandelte Stuten können als Empfängertiere eingesetzt werden. Als Spendertiere eignen sich am besten ausgewachsene Stuten mit gesundem Reproduktionstrakt. Die Embryogewinnungsrate kann bei diesen Stuten bis zu 90 % erreichen. Bei älteren, subfertilen Stuten beträgt die Embryogewinnungsrate dagegen nur zwischen 20 und 40 %. Die transvaginale Spülung des gesamten Uterus ist heute die Methode der Wahl zur Gewinnung der Embryonen (nicht-chirurgische Gewinnung). Der frühest mögliche Zeitpunkt für die nicht-chirurgische Embryogewinnung ist der 6. Tag post ovulationem. Der Transfer auf die Empfängerstuten kann entweder chirurgisch von der Flanke aus oder nicht-chirurgisch (transzervikal) erfolgen. Mit der chirurgischen Methode können Trächtigkeitsraten bis zu 80 % erreicht werden, weshalb sie beim kommerziellen Transfer hauptsächlich eingesetzt wird. Die Vorteile des nicht-chirurgischen Transfers sind die geringere Invasivität und die niedrigeren Kosten, Nachteil ist die grössere Variation der Trächtigkeitsraten. Die Kühlung und der Transport der Embryonen bietet viele Vorteile bezüglich des Managements eines Transferprogrammes. Die gekühlte Lagerung für 24 bis 30 Stunden scheint die Lebensfähigkeit der Embryonen nicht oder nur geringfügig zu beeinflussen. Die Kryokonservierung von Pferdeembryonen kann entweder mit der konventionellen Methode oder mit der Vitrifikation durchgeführt werden. Kleinere Embryonen überleben die Kryokonservierung besser als große Embryonen. Mikrochirurgische Eingriffe an Pferdeembryonen können zur Produktion monozygoter Zwillinge und zum Sexing der Embryonen eingesetzt werden. Die Erzeugung von Embryonen durch extrakorporale Befruchtung hat beim Pferd bisher nur geringe Effizienz. Die Gewinnung von Oozyten kann auf vier verschiedene Arten erfolgen: chirurgisch, durch Follikelpunktion von der Flanke aus, durch transvaginale Follikelpunktion und aus Ovarien von Schlachttieren. Die in vitro-Reifung der Pferdeoozyten ist in verschiedenen Kulturmedien möglich. Nach 30 stündiger Kultur in TCM 199 erreichen bis zu 80 % der Oozyten die Metaphase II. Eine Befruchtung der Oozyten in vivo kann durch den chirurgischen Transfer in den Eileiter, durch den Gamete Intrafallopian Tube Transfer (GIFT) und durch intrafollikulären Transfer stattfinden. Während beim GIFT auch die Spermien in den Eileiter übertragen werden, erfolgt die Besamung bei den anderen Methoden intrauterin. Der Vorteil des GIFT ist, dass nur geringe Spermienzahlen notwendig sind, weshalb sich diese Methode besonders für subfertile Hengste, Tiefgefriersperma oder gesextes Sperma eignet. Die Kryokonservierung der Oozyten ist ebenfalls durch die konventionelle Methode oder durch Vitrifikation möglich. Tiefgefrorene Oozyten zeigen eine geringere Reifungsrate als ungefrorene Oozyten, die Befruchtungsraten nach IVF waren jedoch vergleichbar. Dagegen scheint die Embryoentwicklungsrate von kryokonservierten Oozyten beeinträchtigt zu sein. Die in vitro-Fertilisation gereifter Oozyten kann durch die Co-Inkubation mit Sperma oder durch assistierte Fertilisationstechniken wie mechanische Manipulation der Zona pellucida, Zona drilling und intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI) erfolgen. Mit der konventionellen IVF wurden bisher nur geringe Fertilisationsraten (0-25 %) erzielt, während man mit der intrazytoplasmatischen Spermieninjektion Fertilisationsraten von bis zu 52 % erreichen konnte. Beide Techniken haben nach dem Transfer zur Geburt lebender Fohlen geführt. Zur Reifung der befruchteten Oozyten bis zum Morula- oder Blastozystenstadium ist sowohl die Kultur in vivo als auch in vitro geeignet. Bei der in vitro-Kultur scheint die Co-Kultur mit somatischen Zellen für die Entwicklung der Embryonen entscheidend zu sein. Die Produktion lebender Fohlen aus in vitro kultivierten Embryonen, welche aus in vitro gereiften Oozyten durch intrazytoplasmatische Spermieninjektion entstanden waren, ist bereits gelungen.