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Wehrle, Esther (2010): Development, establishment and implementation of molecular biological methods for the detection of enterotoxinogenic Bacillus cereus. Dissertation, LMU München: Faculty of Veterinary Medicine
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Abstract

Bacillus cereus ist als Sporenbildner mit ubiquitärem Vorkommen sowie ausgeprägten lipo- und proteolytischen Eigenschaften ein Problemkeim in der Lebensmitteltechnologie und -hygiene und verursacht Lebensmittelintoxikationen und -infektionen, die zu den wichtigsten lebensmittelassoziierten Krankheiten gezählt werden. Derzeit besteht in der Routinediagnostik ein Mangel an schnellen und zuverlässigen Methoden zur simultanen Detektion der für diese Erkrankungen kausalen B. cereus Toxine bzw. der zugrunde liegenden Toxin-Gene hbl, nhe, ces und cytK1. Im Rahmen dieser Studie wurden deshalb konventionelle und real-time multiplex PCRs zum simultanen Nachweis der B. cereus Toxin-Gene (hbl, nhe, ces und cytK1) entwickelt und an zuvor bereits immunologisch, zell- und molekularbiologisch charakterisierten B. cereus Stämmen (n = 146) der Stammsammlung des Instituts etabliert: Zur Anwendung in konventionellen Systemen konnten vier multiplex PCRs (PCR 1 – 4) realisiert werden, wobei PCR 1 und 2 dem gleichzeitigen Nachweis der Gene hblC, nheA, ces (PCR1) bzw. hblC, nheA, ces und cytK1 (PCR 2) dienen und mit PCR 3 und 4 die spezifische Detektion der Gene hblC, hblD und hblA bzw. nheA, nheB und nheC ermöglicht wird. Sowohl in den beiden Screening PCRs als auch in den PCRs zur Feindifferenzierung wurde eine Interne Amplifikationskontrolle (IAC) eingesetzt. Für die Applikation in real-time Systemen wurde eine auf SYBR Green I basierende multiplex PCR zur Detektion der B. cereus Toxin-Gene hblD, nheA, ces und cytK1 entwickelt und erfolgreich in den Cyclern LC 2.0 und LC 480 eingesetzt. Die Schwellenwert-Zyklen der multiplex Reaktionen stimmten gut mit denen der singleplex Assays überein und es konnte kein relevanter Sensitivitätsverlust festgestellt werden. In beiden Cyclern wurden für die vier Amplifikate signifikante Unterschiede der Schmelztemperaturen berechnet (p < 0,001). Anschließend wurden die multiplex PCRs zur Charakterisierung von Bacillus cereus Isolaten (n = 208) aus Lebensmittel- und Hygienestatuskontrollen der Bundeswehr eingesetzt. Anhand der detektierten Toxin-Gene konnten die B. cereus Isolate in drei Profile eingeteilt werden (nhe + hbl; nhe + ces; nhe) mit Prävalenzen von 99,5 % für nhe, 62,9 % für hbl sowie 4,3 % für ces. In einem zweiten Schritt wurden die B. cereus Isolate mit validierten, auf monoklonalen Antikörpern basierenden Enzymimmuntests und Zytotoxizitätstests untersucht, wobei eine hohe Übereinstimmung der mit den drei unabhängigen Methoden (PCR, EIA, Zelltest) erhaltenen Ergebnisse verzeichnet wurde. Im Vergleich zu früheren Studien konnte somit eine deutliche Verbesserung der Zuverlässigkeit der molekularbiologischen Ergebnisse erreicht werden.

Abstract

Due to its spore-forming ability combined with ubiquitary occurrence and highly lipolytic and proteolytic properties Bacillus cereus represents a problematic microorganismn in food technology and food hygiene and causes food intoxications and food infections, which are counted among the major food associated diseases. Currently, in routine diagnostics there is a lack of fast and reliable methods for simultaneous detection of the causative toxins and alternatively the underlying toxin genes hbl, nhe, ces and cytK1. Therefore, this study deals with the development of conventional and real-time multiplex PCRs for the simultaneous detection of B. cereus toxin genes (hbl, nhe, ces and cytK1). All methods were established using well characterized B. cereus strains (n = 146) from the strain collection of the institute previously tested with immunological, cellular and molecular biological assays: We developed a total of four conventional multiplex PCRs (PCR 1 – 4) enabling simultaneous detection of genes hblC, nheA, ces in PCR1 and hblC, nheA, ces and cytK1 in PCR 2 as well as the specific analysis of genes hblC, hblD, hblA and nheA, nheB, nheC in PCR 3 and PCR 4, respectively. An internal amplification control (IAC) was implemented in both, the two screening PCRs and the PCRs for fine-typing. For application in real-time systems a multiplex PCR based on SYBR Green I was developed for the detection of B. cereus toxin genes hblD, nheA, ces and cytK1 and successfully applied to cyclers LC 2.0 and LC 480. The threshold cycles in the multiplex assay were in good accordance with the values obtained in the singleplex PCRs and no relevant reduction in sensitivity was observed. In both cyclers significant differences of melting temperatures were calculated for the four PCR products (p < 0.001). Subsequently, the multiplex PCRs were applied for characterization of Bacillus cereus isolates (n = 208) derived from food and hygiene status controls in facilities of the German Federal Armed Forces. The B. cereus isolates could be subdivided into three profiles according to the detected toxin genes (nhe + hbl; nhe + ces; nhe) and prevalences of 99.5 % for nhe, 62.9 % for hbl and 4.3 % for ces were observed. Afterwards the B. cereus isolates were tested with validated enzyme immunoassays based on monoclonal antibodies and cytotoxicity tests. The results obtained with the three independent methods (PCR, EIA, cell test) were in good agreement. Thus, compared to previous studies a considerable improvement was achieved regarding the reliability of molecular biological results.