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Zimmermann, Timo (2000): Analyse der Zellsortierung und Zellbewegung von Dictyostelium discoideum mittels konfokaler 4DMikroskopie. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Methoden der multidimensionalen konfokalen Mikroskopie wurden für die in vivo Beobachtung dynamischer Prozesse in der Amöbe Dictyostelium discoideum verwendet. Um diese Vorgänge sichtbar zu machen, wurde Grün Fluoreszierendes Protein (GFP) als Reporter von Genexpression und als Fusionsprotein eingesetzt. Mit Hilfe von 4D-Mikroskopie und Mehrkanal-Detektion konnten dabei in vivo die Zellsortierung in vielzelligen Aggregaten und die intrazelluläre Lokalisierung des Zytoskelett-Proteins Severin visualisiert und analysiert werden. Es wurde eine Methode entwickelt, spektral unterschiedliche GFP-Varianten im Konfokalmikroskop simultan zu detektieren und verläßlich zu trennen. Aufgrund der Anregungswellenlänge und der Verwendung nur eines Aufnahmevorgangs zur Erfassung beider GFP-Varianten eignet sich dieser Ansatz zur schonenden Beobachtung lebender Zellen auch über längere Zeiträume. Diese Eigenschaften ermöglichen darüber hinaus die Verwendung dieser Konfiguration bei den wiederholten Aufnahmen einer 4D-Messung. In D. discoideum-Slugs wurde die Lokalisierung von Prestalk-Zellen (pstA- und pst0-Zellen) während der Migration und der Spitzenneubildung mit GFP als Reporter für spezifische Genexpression untersucht. In migrierenden Slugs fallen Prestalk-Zellen aus dem pstA-Bereich der Spitze in den Prespore-Bereich zurück. Dieses Zurückfallen in der zentralen Längsachse läßt sich durch die Organisation der Spitzenregion durch cAMP-Spiralwellen mit einem Zentrum in der Längsachse erklären. Prestalk-Zellen gelangen über diesen Weg aus der Spitze in den Prespore-Bereich. An der Neubildung von Spitzen im Prespore-Bereich sind ehemalige Prestalk-Zellen gemeinsam mit den Anterior-like-Zellen des Prespore-Bereichs maßgeblich beteiligt. Diese Zelltypen bewegen sich an die Slugoberseite und bilden dort rotierende Zentren, aus denen sich neue Spitzen bilden. Das Verhalten dieser Zellgruppen und die 4DTrajektorien einzelner Zellen deuten auf eine Organisation dieser Zentren durch cAMPSignale. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, daß es innerhalb dieser Zellen Gruppen gibt, die zu unterschiedlichen Zeiten in neue Spitzen rekrutiert werden. PstA-Zellen sind in neuen Spitzen wieder im vordersten Bereich lokalisiert, obwohl sie aus dem Prespore-Bereich kommen, während pst0-Zellen im gesamten Prestalk-Bereich zu finden sind. Artspezifische Zellsortierungsprozesse gemeinsam vorkommender Dictyostelium-Arten wurden mittels der Markierung von Zellen der beteiligten Arten untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß die Sortierung von D. discoideum/D. mucoroides-Mischungen schon in den Aggregationsströmen anfängt und im Mound abgeschlossen wird. Die Trennung erfolgt über Unterschiede in der Zelladhäsion. Erheblich beschleunigt wird dieser Sortierungsvorgang durch die gerichtete chemotaktische Bewegung beider Arten auf dieselben Signale, die bei den sich in den Zellströmen schneller bewegenden D. mucoroides-Zellen zu einer Anreicherung im Moundzentrum führt. Somit sind in vivo zwei Faktoren gemeinsam für die artspezifische Sortierung von D. discoideum und D. mucoroides verantwortlich. In Mischungen von D. discoideum und Polysphondylium spec. geschieht die Aussortierung über die Nutzung unterschiedlicher Botenstoffe für die Chemotaxis, so daß die Arten getrennt aggregieren. Es konnte gezeigt werden, daß diese getrennte Aggregation sehr spezifisch ist und es dennoch zu einer Interaktion zwischen D. discoideum und fortgeschrittenen Polysphondylium-Aggregaten kommt, da in Polysphondylium in späten Aggregationsphasen cAMP für die interzelluläre Kommunikation verwendet wird. In dieser Phase wird von Polysphondylium sowohl cAMP als auch Glorin sekretiert. Severin ist ein mit Gelsolin verwandtes 40 kDa Protein, das F-Aktin-Filamente fragmentiert und an das (+)-Ende des entstehenden Fragments bindet. Mit Hilfe eines GFP-Fusionsproteins wurde die intrazelluläre Lokalisierung dieses Proteins in vivo während einer Vielzahl zellulärer Aktivitäten untersucht. Severin ist in den aktiven Bereichen des F-Aktin Zellkortex angereichert. Obwohl die Morphologie von D. discoideum-Zellen in den verschiedenen Phasen der Entwicklung sehr unterschiedlich ist, ist die Lokalisierung von Severin in allen Stadien primär von der Bildung neuer Zellfortsätze trennbar. Die Anreicherung von Severin ist hingegen mit der Bewegung der Zelle in diese neu gebildeten Fortsätze assoziiert. Erstmals wurde im Rahmen dieser Arbeit der Effekt von cAMP-Signalen auf das Zytoskelett einzelner Zellen in Aggregationsströmen ausführlich dargestellt.