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Wedlich-Söldner, Roland (2001): Zelluläre Rolle und molekulare Grundlagen des Endosomentransports in Ustilago maydis. Dissertation, LMU München: Faculty of Biology
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Abstract

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den molekularen Grundlagen polaren Wachstums im phytopathogenen Basidiomycet Ustilago maydis. Zunächst wurde die zelluläre Rolle des t-SNAREs Yup1 analysiert. Ein temperatursensitiver Defekt im yup1-Gen hatte zu Störungen in der Zelltrennung und im polaren Wachstum von Sporidien geführt. Mutante Zellen bildeten dabei lange verzweigte Ketten aus verdickten Zellen. Die Lokalisation eines Yup1-GFPFusionsproteins auf beweglichen Organellen hatte zum Aufstellen eines spekulativen Modells geführt, bei dem Yup1 auf Endosomen die Fusion mit ankommenden endozytotischen Vesikeln vermittelt. Eine erstmalige Charakterisierung der Endozytose von U. maydis in dieser Arbeit zeigte, dass es sich bei den mit Yup1-GFP markierten, schnellen Organellen tatsächlich um frühe Endosomen handelte. Diese akkumulierten Zellzyklus-abhängig an Regionen aktiven Wachstums in BSDs. Die Akkumulation früher Endosomen im Apex von Hyphen war für das Spitzenwachstum erforderlich. In yup1ts-Zellen war bei restriktiver Temperatur eine gestörte Endozytose zu beobachten. Dieser Zusammenhang zwischen Zellmorphologie und polarer Sekretion einerseits und Endozytose andererseits deutete darauf hin, dass Membranrecycling über frühe Endosomen entscheidend am polaren Wachstum von U. maydis-Zellen im Speziellen und pilzlichen Hyphen im Allgemeinen mitwirkt. Mittels des Yup1-GFP-Fusionsproteins konnten die molekularen Grundlagen der beobachteten Bewegung von Endosomen untersucht werden. Es wurde gezeigt, dass sich frühe Endosomen entlang von MT bewegen. Für diese Bewegung war in erster Linie das Kinesin Kin3 verantwortlich. Dieses Molekül ist ein neues Mitglied der Unc104/KIF1-Familie von Kinesin-ähnlichen molekularen Motoren und bewegt als solches vermutlich in Richtung der plus-Enden von MT. Gelfiltrationsexperimente legten nahe, dass Kin3 in der Zelle als Monomer vorliegt. Die N-terminale Motordomäne zeigte in vitro eine MTstimulierte ATPase Aktivität. Ein Kin3-GFP-Fusionsprotein lokalisierte in schnell beweglichen Flecken, die im Bewegungsverhalten den frühen Endosomen glichen. Ein Kin3-YFP-Fusionsprotein bewegte entlang von MT und kolokalisierte zudem mit einem Yup1-CFP-Fusionsprotein auf Endosomen. Die Deletion von kin3 führte zu einer starken Reduzierung der Endosomenbewegung. Die in vivo-Untersuchung der MT-Dynamik im Δkin3-Stamm ergab, dass der Großteil der Endosomen in Akkumulationen an den minus-Enden der MT konzentriert war. Entsprechend führte die Überexpression von kin3 zu einer verstärkten Konzentration der Endosomen an den plus-Enden von MT. Die Zellform einzelner Sporidien war im kin3-Deletionsstamm nicht verändert. Allerdings trennten sich die Zellen nach der Teilung wie in der yup1ts-Mutante nicht voneinander. Dieser Trennungsdefekt und ein verändertes Knospungsmuster führten zur Bildung von großen Baum-ähnlichen Zellaggregaten. Im Hyphenstadium führte die Deletion von kin3 außerdem zu einer deutlichen Störung des polaren Wachstums. Die nach Deletion von kin3 beobachtete Restbewegung der Endosomen beruhte fast ausschließlich auf der Aktivität des zytoplasmatischen Dyneins von U. maydis. Das konventionelle Kinesin von U. maydis, Kin2, zeigte ebenfalls einen Einfluss auf die Organisation und Position endosomaler Akkumulationen, obwohl es vermutlich nicht direkt am Transport einzelner Endosomen beteiligt ist. Die präsentierten Daten zeigen, dass Endosomen MT- und Zellzyklus-abhängig organisiert sind. Die Position der BSDs korrelierte dabei mit Funktionen der Endosomen bei der Zelltrennung, in der Bestimmung des Knospungsmusters und beim polaren Wachstum. Da die MT während des Knospenwachstums unipolar ausgerichtet sind, nutzt die U. maydis-Zelle das Wechselspiel des plus-Motors Kin3 und des minus-Motors Dynein, um die Endosomen Zellzyklus-abhängig an den plus- oder minus-Enden der MT zu akkumulieren.